JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 4:53 분 • July 8th, 2025
폴리-D-라이신으로 코팅된 투과성 멤브레인 인서트가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
성상세포 성장 배지를 웰에 추가하고 특수한 신경교세포인 성상세포를 삽입물에 시드합니다.
정전기 상호 작용을 통해 폴리-D-라이신에 세포가 부착되고 단층을 형성하도록 배양합니다.
성상세포 배지를 뉴런 배양 배지로 교체하십시오.
이 인서트를 폴리머 코팅된 커버슬립 위에 부착된 일차 마우스 배아 뉴런을 포함하는 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.
배양하여 간접 뉴런-성상세포 공동 배양을 확립하며, 여기서 두 세포 유형은 물리적으로 분리되지만 동일한 배양 배지를 공유합니다.
성상세포는 뉴런의 생존과 성장에 필수적인 다양한 신경영양 인자를 분비합니다.
이러한 인자는 투과성 지지대를 통해 이동하고 1차 뉴런과 상호 작용합니다. 이것은 분화를 촉진하고 신경 투영을 형성합니다.
이러한 돌출은 뉴런 사이의 시냅스 연결을 늘리고 설정하여 뉴런-신경교세포 상호 작용을 나타냅니다.
각 인서트에 폴리-D-라이신 밀리리터당 10마이크로그램을 코팅하고 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후 삽입물을 PBS로 두 번 세척합니다.
그동안 성상세포 배지를 흡인하고 10밀리리터의 PBS로 배양물을 한 번 세척하여 잔류 혈청이 제거되도록 합니다. 다음으로, 3밀리리터의 0.05% 트립신 EDTA를 플라스크에 첨가하고 트립신화를 위해 세포를 약 10분 동안 배양합니다. 그 후, 세포를 7밀리리터의 성상세포 배지에 부드럽게 재현탁합니다.
세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 216배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 성상세포 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 그 후, 24웰 플레이트를 웰당 500마이크로리터의 성상세포 배지로 채웁니다. PBS를 흡인하고 500마이크로리터의 성상세포 배지에 있는 25,000개의 세포를 각 개별 삽입물로 옮기고 배양액을 섭씨 37도에서 배양합니다.
해마를 해부하려면 준비 배지로 채워진 10cm 접시 3개와 1밀리리터 준비 배지가 담긴 2밀리리터 튜브 1개를 준비합니다. 피질 부분에서 해마를 해부하고 준비 배지로 채워진 2밀리리터 튜브에 수집합니다.
해마는 CNS의 다른 영역에서 인접한 조직 없이 분리되는 것이 중요합니다. 따라서 해마를 제거한 후 이물질 오염 조직을 추가로 제거해야 합니다.
해부 후 튜브를 멸균 층류 벤치로 옮깁니다. 준비 배지를 조심스럽게 제거하고 파파인이 함유된 소화 용액 1ml로 해마 조직을 소화합니다. 15분 동안 소화 한 후 피펫으로 부드럽게 흡입하여 소화 용액을 조심스럽게 빼냅니다.
뉴런의 높은 민감도로 인해 기포를 피하고 최적의 분쇄 강도를 얻기 위해 해마를 조심스럽게 분쇄하는 것이 중요합니다.
세척 주기당 신선한 배양 배지 1밀리리터를 추가하고 조심스럽게 흡인하여 뉴런 배지로 해마를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 단계 후, 1밀리리터의 뉴런 배지에서 조직을 조심스럽게 분쇄합니다. 그런 다음 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 24웰 플레이트의 웰당 500마이크로리터의 뉴런 배지에 35,000개의 세포를 플레이트하고 뉴런을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
이제 인큐베이터에서 합류 성상세포 단층으로 시딩된 준비된 삽입물을 꺼냅니다. 성상세포 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 신선한 뉴런 배지로 교체하여 배지를 교환합니다.
그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 뉴런 배양이 포함된 웰에 성상세포가 있는 삽입물을 조심스럽게 배치합니다. 그 후, 생성된 간접 뉴런 성상세포 공동 배양을 실험이 끝날 때까지 인큐베이터에 다시 넣습니다.