In vitro에서 뉴런 및 대식세포 공동 배양 개발

성장 배지에서 분리된 쥐 후근 신경절 뉴런으로 시작합니다.

폴리머 코팅된 멀티웰 플레이트에 시딩하여 뉴런 부착을 촉진합니다.

다음으로, 해부된 안락사된 마우스를 가져와 얼음처럼 차가운 PBS를 복막강에 주입합니다.

복막을 부드럽게 마사지하여 복막벽에서 대식세포를 제거합니다.

마우스를 짜서 복막액을 수집하고 용해 완충액으로 처리하여 오염 물질로 나타나는 적혈구를 선택적으로 용해합니다. 세포를 원심분리하고 배양 배지에 재현탁합니다.

대식세포를 배양된 뉴런을 포함하는 웰 내에 위치한 다공성 삽입물로 옮깁니다.

이 공동 배양을 통해 뉴런과 대식세포가 근접하게 될 수 있습니다.

db-cAMP로 공동 배양을 처리하고 세포로의 진입을 용이하게 하기 위해 배양합니다. 이것은 뉴런을 활성화하여 신호 분자를 분비합니다.

이러한 신호 분자는 db-cAMP와 함께 대식세포가 재생 촉진 표현형을 채택하고 신경 성장을 위한 필수 인자를 분비하도록 유도합니다.

배양을 설정하기 전에 6웰 플레이트에 폴리-D-라이신과 라미닌을 미리 코팅합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 0.01 폴리-D-라이신과 함께 배양합니다. 그런 다음 증류수로 접시를 두 번 씻으십시오.

그런 다음 실온에서 2시간 동안 밀리리터당 3마이크로그램의 농도로 라미닌 용액과 함께 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 증류수로 접시를 두 번 세척하고 접시를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.

이제 안락사된 쥐의 척추 위에 있는 피부를 수술용 칼날로 절개하고 척추주위 근육을 양측으로 해부하여 척추뼈를 노출시킵니다. DRG가 완전히 노출될 때까지 끝이 좁은 수술용 론듀어를 사용하여 척추뼈를 꼼꼼하게 제거합니다.

해부 현미경으로 홍채 절제술 가위와 끝이 가는 겸자를 사용하여 S1에서 C1 수준까지 DRG를 양측으로 제거합니다. 끝이 절단된 파란색 피펫 팁을 사용하여 DRG를 1.5밀리리터 Eppendorf 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 미니 원심분리기를 사용하여 몇 초 동안 빠르게 회전시킨 후 DMEM을 제거합니다. 밀리리터당 125단위를 함유한 DMEM 11밀리리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 트위스트 또는 셰이커를 사용하여 부드럽게 회전하면서 튜브를 90분 동안 배양합니다.

그런 다음 콜라게나제 함유 DMEM을 버리고 신선한 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 끝이 절단된 파란색 피펫 팁을 사용하여 DRG를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 균질한 세포 현탁액을 만들기 위해 최소 15회 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다.

튜브를 239g에서 3분 동안 원심분리하고 떠다니는 파편이 있는 상청액을 조심스럽게 버립니다. B27이 보충된 신경기저 배지 1밀리리터를 추가하고 세포 펠릿을 위아래로 5-10회 부드럽게 피펫팅하여 다시 현탁합니다.

다음으로, 50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 겹쳐진 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 그런 다음 수집된 모든 DRG 뉴런을 6웰 플레이트의 두 웰에 도금합니다.

성체 마우스로부터 일차 복막 대식세포를 준비하려면 복부 피부를 섬세하게 절개하여 복막을 노출시키고 세척액의 누출을 방지하기 위해 복막을 절단하지 마십시오.

다음으로, 22게이지 바늘이 달린 주사기를 사용하여 복막에 구멍을 뚫고 얼음처럼 차가운 PBS 10밀리리터를 복막강에 주입합니다. 복막을 1-2분 동안 부드럽게 마사지합니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 바늘 천자 부위를 통해 PBS를 짜내고 50밀리리터 원추형 튜브에 세척액을 모으십시오.

그 후, 세척액을 섭씨 4도에서 10분 동안 239g 으로 원심분리하여 세포 성분을 펠릿화합니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 적혈구 용해 완충액 3밀리리터와 함께 펠릿을 다시 현탁합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 239g 으로 다시 원심분리합니다. 펠릿화된 세포를 신경기저 B27 배지 1밀리리터에 다시 현탁합니다. 해리된 DRG의 웰 위에 놓인 유효 면적이 4.2센티미터 제곱인 세포 배양 삽입물에 수집된 모든 대식세포의 절반을 플레이트합니다.

뉴런 대식세포가 공동 배양된 후 4시간 후, 뉴런 대식세포 공동 배양에 2마이크로리터의 100마이크로몰 db-고리형 AMP 용액을 추가합니다. 24시간 후, 동일한 6웰 플레이트에 1밀리리터의 대식세포 배양 배지로 빈 웰을 채웁니다.

뉴런 대식세포 공동 배양의 세포 배양 삽입물을 대식세포 배양 배지가 있는 빈 웰로 옮깁니다.