0 조회수 • 3:32 분 • July 8th, 2025
다양한 세포 기능을 조절하는 신호 분자인 고리형 아데노신 일인산(cAMP)부터 시작하십시오. 뉴런-대식세포 공동 배양에 cAMP를 추가합니다.
배지의 cAMP 분자와 뉴런의 성장 인자는 대식세포 활성화를 유발합니다.
활성화된 대식세포가 있는 삽입물을 대식세포 배양 배지가 들어 있는 다른 웰로 옮깁니다.
여기서 대식세포는 사이토카인과 케모카인을 배지로 방출하여 조절된 배지 또는 CM을 형성합니다.
CM을 원심분리하여 세포 성분을 펠릿화합니다.
상층액과 필터를 옮겨 세포 파편을 제거합니다.
수집된 CM을 신경 배양에 추가합니다. 수집된 CM의 사이토카인과 케모카인은 뉴런 확장을 촉진합니다.
냉각된 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정시킵니다.
항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 완충액을 추가합니다. 잔류 완충액을 제거하기 위해 세척하십시오.
뉴런의 세포골격 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 적용합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.
1차 항체에 결합하는 적색 형광단 접합 2차 항체를 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.
형광 현미경을 사용하여 확장이 있는 빨간색 뉴런을 시각화합니다.
뉴런 대식세포가 공동 배양된 후 4시간 후, 뉴런 대식세포 공동 배양에 2마이크로리터의 100마이크로몰 db-cAMP 용액을 추가합니다. 24시간 후, 동일한 6웰 플레이트에 1밀리리터의 대식세포 배양 배지로 빈 웰을 채웁니다.
뉴런 대식세포 공동 배양의 세포 배양 삽입물을 대식세포 배양 배지가 있는 빈 웰로 옮깁니다. 72시간 후, 대식세포 조절 배지를 239g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 성분 을 제거합니다. 상청액을 0.2마이크로미터 필터에 통과시켜 남아 있는 세포 파편을 제거합니다.
이 절차에서는 8웰 챔버 슬라이드를 폴리 D-라이신과 라미닌으로 사전 코팅합니다. 그런 다음 B 27로 보충된 신경기저 배지에서 관련 성인 DRG 뉴런을 얻습니다. 웰당 5 x 104개의 세포를 사전 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 도금합니다.
그런 다음 챔버 슬라이드를 섭씨 37도 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 세포가 바닥에 부착되도록 합니다. 그런 다음 배양 배지를 섭씨 37도로 예열된 해동된 컨디셔닝 배지로 교체합니다. 초기 도금 후 15시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
그런 다음 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액 200마이크로리터를 웰에 넣고 세포를 파라포름알데히드 용액과 함께 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 그 후, 고정 세포를 10% 정상 염소 혈청으로 희석한 1차 항체 용액과 함께 실온에서 4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하여 신경돌기 성장을 시각화합니다.
본 연구는 대식세포를 활성화하는 데 있어 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)의 역할과 이것이 신경세포 배양에 미치는 후속 영향을 조사합니다. 연구 방법은 신경세포와 대식세포를 공동 배양하고, 조건화 배지가 신경돌기 성장(neurite outgrowth)에 미치는 영향을 분석하는 과정을 포함합니다.
이 방법은 신경돌기 성장을 유도하는 대식세포 유래 수용성 인자를 정량화함으로써 신경면역 상호작용의 기전적 위험 요소를 제거하며, 신경퇴행성 질환 모델에서의 타겟 검증을 지원합니다. 이 분석법은 뉴런 회복을 촉진할 가능성이 있는 면역 조절 화합물을 평가하기 위한 질환 관련 시스템을 제공하여, 신약 발굴 파이프라인의 초기 단계에서 진행 또는 중단(go/no-go) 결정을 내리는 데 도움을 줍니다. 또한, 면역 활성화를 기능적 뉴런 표현형과 연결함으로써 리드 화합물 발굴 단계에서의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
본 분석법은 타겟 가설 검증부터 리드 물질 발굴, 그리고 전임상 효능 평가에 이르는 발견 연속체 범위에 부합하며, 신경 세포 건강에 미치는 면역 조절 효과에 대한 기능적 판독값을 제공합니다.
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마지막 업데이트: 29 8월 2026