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신경과학
0 조회수 • 4:51 분 • July 8th, 2025
안락사된 쥐를 예로 들어보겠습니다.
복부를 열고 방광을 절제한 후 완충액에 담급니다.
방광을 자르고 부착된 지방과 조직 파편을 제거합니다.
방광을 완충액이 들어 있는 튜브로 옮기고 원심분리하여 잔해물을 제거합니다.
콜라게나제가 함유된 용액에 조직을 넣고 다집니다. 콜라게나제를 더 첨가하여 세포외 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다. 트립신을 첨가하여 세포-세포 접합을 방해하여 세포를 방출합니다.
트립신을 비활성화하기 위해 단백질이 포함된 헹굼 배지를 첨가한 다음 원심분리하고 상청액을 제거합니다.
세포를 배지에 재현탁하고, 응집체를 제거하기 위해 여과하고, 단일 세포 현탁액을 얻는다.
원심분리하여 상층액을 제거합니다. 배지에 세포를 재현탁합니다.
코팅된 커버슬립에 세포를 도금하여 신경 및 신경교 세포 부착을 용이하게 합니다. 부착되지 않은 셀을 제거합니다.
성장 인자를 함유한 뉴런 배지를 첨가하여 세포 성숙을 촉진하고 1차 뉴런 및 신경교 배양을 확립합니다.
멸균된 수술용 수건 위에 쥐를 놓고 복부를 노출시키는 것부터 시작하십시오. 가위와 집게를 사용하여 복강을 열고 방광을 드러냅니다. 다른 가위와 집게를 사용하여 방광을 부드럽게 들어 올려 방광 목에서 잘라냅니다.
그런 다음 방광을 차갑고 산소에 안정적인 크렙스 용액에 빠르게 넣어 세포 생존율을 향상시킵니다. 크렙스 용액을 유리 접시 3개와 유리 비커 3개에 넣고 얼음 욕조에 넣어 예식시킵니다. 혼동을 방지하기 위해 접시와 비커에 1, 2, 3의 번호를 매깁니다.
유리 접시 1에서 안과용 가위로 방광을 열고 집게와 숟가락 핵 칸막이로 펼칩니다. 유리 비커 1에 방광을 헹구고 유리 접시 2에 넣습니다. 집게와 안과용 가위를 사용하여 조직 표면의 부착 지방을 제거합니다. 그런 다음 비커 2에 방광을 헹구고 접시 3에 넣습니다.
집게와 숟가락 핵 분배기를 사용하여 방광을 부드럽게 긁어 외인성 부착물을 제거합니다. 유리 비커 3에서 방광을 헹구고 15밀리리터의 차가운 크렙스 용액이 담긴 14밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 360배 g 및 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리합니다.
원심분리기 튜브에서 1밀리리터의 소화 용액이 들어 있는 2밀리리터 바이알로 방광을 옮깁니다. 안과용 가위를 사용하여 방광을 작은 조각으로 자릅니다. 멸균 세포 배양 접시에서 방광 용액 9밀리리터와 소화 용액 1을 혼합합니다. 섭씨 37도, 200RPM에서 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 진탕 인큐베이터에서 첫 번째 분해를 수행합니다. 첫 번째 소화 후 용액을 300배g, 섭씨 4도에서 8분 동안 원심분리합니다.
한편, 소화액 2를 섭씨 37도 수조에 넣어 예열합니다. 원심분리 후 소화액 1을 포함하는 상청액의 대부분을 제거하고 세포 손실을 방지하기 위해 일부 상청액을 남깁니다.
세포를 따뜻한 소화 용액 2에 재현탁하고 섭씨 37도 수조에서 5분 동안 소화하면서 혼합물을 흔듭니다. 소화가 완료되면 10밀리리터의 콜드 린스 매체를 추가하여 트립신을 즉시 비활성화합니다. 세포를 360배 g 및 섭씨 4도에서 8분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 가능한 한 많은 상청액을 제거하여 모든 트립신을 제거합니다.
3밀리리터의 뉴런 배지로 침전물을 부드럽게 재현탁시키면서 용액에 기포가 생성되지 않도록 합니다. 현탁액을 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50밀리리터 원심분리기 튜브로 여과합니다. 섭씨 4도에서 360배g에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1밀리리터의 뉴런 배지 A에 부드럽게 재현탁하고 500웰 플레이트의 각 웰에 48마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다.