Plastic Microfluidic Chips를 사용한 분류된 1차 쥐 뉴런 배양

홈으로 연결된 체세포 저장소와 구획, 축삭 저장소 및 구획으로 구성된 플라스틱 미세유체 칩을 가져 가십시오.

사전 코팅 용액을 추가하여 구획과 홈을 포화시켜 기포 갇힘을 방지합니다.

용액을 흡인하고 메인 구획을 채웁니다. 완충액으로 씻으십시오.

신경 접착을 촉진하는 합성 폴리머로 웰을 코팅합니다. 완충액으로 세척하고 칩이 건조되지 않도록 배양 배지를 추가합니다.

쥐 해마 뉴런의 현탁액을 파종하려면 배지를 흡인하십시오.

서스펜션을 체세포 저장소에 넣습니다. 뉴런은 체세포 구획에 들어가 부착됩니다.

웰에 신경 배양 배지를 추가하고 배양합니다. 배지에 존재하는 성장 인자는 신경 성장을 촉진합니다.

점차적으로 뉴런은 축삭을 확장하여 미세 홈을 통해 축삭 구획으로 자랍니다.

홈의 좁음은 신경 세포체의 진입을 방지하여 체세포 영역과 축삭 영역의 물리적 분리를 보장합니다.

시작하려면 멸균 다중 구획 칩을 페트리 접시에 넣습니다. 칩의 왼쪽 상단 웰에 100마이크로리터의 사전 코팅 용액을 추가하고 메인 채널을 통해 인접한 웰로 흐르도록 합니다. 다음으로, 칩의 왼쪽 하단 웰을 100마이크로리터의 사전 코팅 용액으로 채웁니다.

이번에는 용액이 마이크로 홈을 통해 흐를 때까지 5분 동안 기다리십시오. 이제 100마이크로리터의 사전 코팅 용액을 오른쪽 상단 우물에 추가하고 주 채널을 통해 인접한 우물로 흐르도록 합니다. 90초 후, 오른쪽 하단 우물에 100마이크로리터의 사전 코팅 용액을 채우고 칩을 10분 동안 배양합니다.

피펫 팁을 주 채널에서 멀리 조심스럽게 기울이고 각 웰에서 용액을 흡인합니다. 그런 다음 즉시 왼쪽 상단 우물에 150마이크로리터의 PBS를 넣고 1.5분 동안 기다립니다. 그런 다음 왼쪽 하단 웰에 150마이크로리터의 PBS를 추가하고 액체가 마이크로홈을 통해 흐르도록 5분 동안 기다립니다.

그런 다음 150마이크로리터의 PBS를 오른쪽 상단과 오른쪽 하단 웰에 순서대로 추가합니다. 10분 후 다시 PBS를 흡인하고 세척 단계를 두 번째로 반복합니다. 두 번째 세척 후 피펫 팁을 채널 개구부에서 멀어지게 하여 이전과 같이 우물을 PBS를 흡인합니다.

그런 다음 폴리-D-라이신 용액 ml당 0.5mg의 100마이크로리터를 칩의 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 1분 1/2분 정도 기다린 다음 왼쪽 하단을 100마이크로리터의 폴리-D-라이신 용액으로 채웁니다. 칩의 오른쪽 절반에서 이 과정을 반복합니다. 페트리 접시를 닫은 다음 칩을 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.

배양 후 앞서 설명한 대로 PBS로 칩을 두 번 헹굽니다. 그런 다음 장치에서 PBS를 흡인합니다. 즉시 칩의 왼쪽 상단 웰에 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 추가합니다. 1분 1/2분 후 왼쪽 하단에 용지를 넣습니다.

매체가 마이크로 홈을 통해 흐르도록 5분 정도 기다린 다음 칩 오른쪽에서 충전 과정을 반복합니다. 확립된 프로토콜에 따라 해리된 쥐 해마 뉴런의 세포 현탁액을 준비합니다. 칩의 각 웰에서 대부분의 배지를 제거하되 채널은 채워 둡니다.

그런 다음 즉시 5마이크로리터의 세포 현탁액을 오른쪽 상단 웰에 넣고 또 다른 5마이크로리터의 세포 현탁액을 오른쪽 하단 웰에 로드합니다. 셀을 로드할 때 피펫 끝이 메인 채널을 향하도록 합니다. 세포를 로드한 후 칩을 현미경 스테이지로 옮겨 뉴런이 주 채널에 있는지 확인합니다.

세포가 부착될 때까지 5분 동안 기다린 후, 약 150마이크로리터의 신경 배양 배지를 오른쪽 상단 및 하단 웰 각각에 추가합니다. 그런 다음 왼쪽 상단 및 하단 웰 각각에 150마이크로리터의 배지를 추가합니다. 페트리 접시를 덮고 칩을 섭씨 5도 37도 인큐베이터의 가습 트레이에 넣습니다.