Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

관류된 쥐의 뇌를 예로 들어보세요. 작은 조각으로 다지십시오.

완충액에서 조직을 균질화하여 미세아교세포를 포함한 세포를 방출합니다.

소화되지 않은 조직이 침전되면 세포를 포함하는 상청액을 수집하고 미엘린 분리 완충액을 추가합니다.

내용물을 혼합하고 원심분리하여 미엘린과 파편에서 세포를 분리합니다. 미엘린 파편층과 상청액을 제거합니다.

세포를 완충액에 재현탁하고 피펫을 사용하여 덩어리를 분리합니다.

탁액을 스트레이너에 통과시켜 남아 있는 세포 응집체를 제거합니다.

여과된 세포를 미세아교세포 특이적 단클론 항체로 코팅된 배양 플레이트로 옮깁니다. 미세아교세포 접착을 촉진하기 위해 배양합니다.

완충액으로 세척하여 비부착 세포를 제거합니다. 트립신을 첨가하고 배양하여 미세아교세포를 느슨하게 합니다.

트립신을 제거합니다.

무혈청 배지를 추가합니다. 세포-기질 상호작용을 약화시키기 위해 얼음 위에서 배양합니다.

펫팅하고 현탁액을 튜브에 모으십시오. 원심분리하여 상층액을 제거합니다.

세아교세포를 무혈청 배지에 재현탁하고 콜라겐 코팅된 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 미세아교세포 접착을 촉진하기 위해 배양합니다.

성장 인자와 지질이 포함된 배지를 추가합니다. 미세아교세포 성숙을 위해 배양합니다.

두뇌를 차가운 DPBS에 모은 후, 차가운 메스 칼날을 사용하여 얼음 위의 페트리 접시에서 각 두뇌를 1입방 밀리미터 덩어리로 자르고 얼음처럼 차가운 5-7밀리리터의 얼음처럼 차가운 더닝 완충제가 있는 얼음처럼 차가운 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 다음으로, 느슨한 Dounce 균질화기를 사용하여 10-20번의 부드럽고 불완전한 스트로크로 조직을 해리시킵니다. 균질화기 바닥의 조직을 직접 부수지 않도록 주의하십시오. 대신 피스톤과 균질화기의 측면 사이의 공간을 통해 조직을 밀어냅니다.

미세아교세포 생존력을 보존하기 위해 여러 차례의 둔킹으로 조직을 천천히 균질화하는 것이 중요합니다.

그런 다음 기포가 생기지 않도록 피스톤을 조심스럽게 제거하십시오. 잘 해리되지 않은 조직 덩어리가 균질화기의 바닥에 가라앉도록 하고 상청액을 냉각된 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그 후, 제거된 부피를 새로운 더닝 완충액으로 교체하고 총 3-4회 동안 또는 모든 조직이 해리될 때까지 해리 절차를 반복합니다.

이 절차에서는 세포 현탁액이 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 더닝 완충액을 추가하고 총 부피를 33.5밀리리터로 조정합니다. 다음으로, 세포 현탁액에 MSB 10밀리리터를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합합니다. 이로 인해 43.5밀리리터의 부피에서 MSB의 최종 농도가 23%가 됩니다.

그 후, 섭씨 4도에서 500g에서 천천히 제동하면서 세포 를 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 미엘린의 최상층과 파편, 상청액을 제거합니다. 최상층을 제거할 때 가능한 한 많이 제거되도록 주의하십시오.

그런 다음 세포 펠릿을 12밀리리터의 패닝 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 분쇄하여 남아 있는 세포 덩어리를 분해합니다. 이 단계에서는 세포 현탁액을 70마이크로미터 세포 스트레이너에 통과시켜 큰 파편이나 세포 덩어리를 제거합니다. OX42 코팅된 패닝 접시를 DPBS로 세 번 헹굽니다. 세탁 사이에 접시가 완전히 마르지 않도록 하십시오.

마지막 DPBS 세척액을 붓고 여과된 세포 현탁액을 패닝 접시에 바릅니다. 플레이트를 부드럽게 휘돌려 세포를 분배시킵니다. 그런 다음 세포가 부착되도록 실온에서 평평한 표면에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 20분 이상 배양하지 않으면 접시에서 세포를 회수하기가 매우 어려워집니다. 그런 다음 패닝 접시를 DPBS로 10회 헹구어 부착되지 않은 세포를 제거합니다.

미세아교세포는 플레이트에 단단히 부착되므로 헹굴 때마다 플레이트를 소용돌이쳐 다른 비부착 세포를 제거합니다. 마지막 DPBS 세척액을 붓고 DPBS 15밀리리터와 트립신 200마이크로리터로 교체합니다.

세포를 트립신화하려면 접시를 섭씨 37도에서 10분 이하 동안 배양합니다. 트립신화 10분 후에도 미세아교세포는 여전히 플레이트에 달라붙습니다. 혼합물을 붓고 DPBS로 플레이트를 부드럽게 두 번 세척하여 트립신을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 MGM 12밀리리터로 교체하십시오.

그런 다음 패닝 접시를 얼음 위에 2분 동안 올려 세포와 기질의 상호 작용을 약화시키고, 패닝 접시 부분이 마르지 않도록 접시가 평평한지 확인합니다. 그 후, 10밀리리터 피펫과 피펫 컨트롤러를 고속으로 세게 피펫팅하여 패닝 접시에서 세포를 회수합니다. 피펫의 액체 흐름으로 16x16 그리드를 그려 모든 세포를 제거해 보십시오.

전반적인 세포 회복과 배양 건강 사이의 균형을 찾는 것이 중요합니다. 패닝 접시에 대해 세포 상청액을 반복적으로 피펫팅하면 배양의 생존력이 감소합니다.

세포가 플레이트에서 분리되었는지 확인하기 위해 20배 배율의 현미경으로 세포를 확인하십시오. 접시 상단에서 세포가 붙어 있는 지점을 표시하고 해당 영역에서 피펫팅을 반복합니다. 세포 현탁액을 수집하고 각 15밀리리터 원뿔형 튜브에 3-4밀리리터의 상청액을 분취합니다. 500g, 섭씨 4도에서 천천히 제 동하면서 15분간 회전

15분 후, 상청액을 흡인하여 세포 펠릿과 함께 0.5밀리리터의 MGM을 남깁니다. 그런 다음 나머지 MGM에 각 펠릿을 재현탁하고 모든 튜브에서 세포를 모으십시오. 그런 다음 혈구계로 세포를 계산합니다.

이제 15마이크로리터의 콜라겐 IV 코팅을 24웰 음이온성, 양이온성 코팅된 조직 배양 플레이트의 중앙에 직접 도금하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 혈구계로 세포를 계수한 후 MGM에서 밀리리터당 2.3 x ^10-5로 희석합니다. 콜라겐 IV 스팟을 흡인하고 즉시 15마이크로리터의 세포 현탁액을 이 스팟에 도금하여 스팟당 3.5 x 10³개의 세포를 생성합니다.

다음으로, 세포가 부착되도록 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 CO₂ 평형 TIC를 웰에 부드럽게 첨가합니다.