Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

관류된 쥐의 뇌를 예로 들어보세요. 작은 조각으로 다지십시오.

완충액에서 조직을 균질화하여 미세아교세포를 포함한 세포를 방출합니다.

소화되지 않은 조직이 침전되면 세포를 포함하는 상청액을 수집하고 미엘린 분리 완충액을 추가합니다.

내용물을 혼합하고 원심분리하여 미엘린과 파편에서 세포를 분리합니다. 미엘린 파편층과 상청액을 제거합니다.

세포를 완충액에 재현탁하고 피펫을 사용하여 덩어리를 분리합니다.

현

탁액을 스트레이너에 통과시켜 남아 있는 세포 응집체를 제거합니다.

여과된 세포를 미세아교세포 특이적 단클론 항체로 코팅된 배양 플레이트로 옮깁니다. 미세아교세포 접착을 촉진하기 위해 배양합니다.

완충액으로 세척하여 비부착 세포를 제거합니다. 트립신을 첨가하고 배양하여 미세아교세포를 느슨하게 합니다.

트립신을 제거합니다.

무혈청 배지를 추가합니다. 세포-기질 상호작용을 약화시키기 위해 얼음 위에서 배양합니다.

피

펫팅하고 현탁액을 튜브에 모으십시오. 원심분리하여 상층액을 제거합니다.

미

세아교세포를 무혈청 배지에 재현탁하고 콜라겐 코팅된 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 미세아교세포 접착을 촉진하기 위해 배양합니다.

성장 인자와 지질이 포함된 배지를 추가합니다. 미세아교세포 성숙을 위해 배양합니다.

두뇌를 차가운 DPBS에 모은 후, 차가운 메스 칼날을 사용하여 얼음 위의 페트리 접시에서 각 두뇌를 1입방 밀리미터 덩어리로 자르고 얼음처럼 차가운 5-7밀리리터의 얼음처럼 차가운 더닝 완충제가 있는 얼음처럼 차가운 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 다음으로, 느슨한 Dounce 균질화기를 사용하여 10-20번의 부드럽고 불완전한 스트로크로 조직을 해리시킵니다. 균질화기 바닥의 조직을 직접 부수지 않도록 주의하십시오. 대신 피스톤과 균질화기의 측면 사이의 공간을 통해 조직을 밀어냅니다.

미세아교세포 생존력을 보존하기 위해 여러 차례의 둔킹으로 조직을 천천히 균질화하는 것이 중요합니다.

그런 다음 기포가 생기지 않도록 피스톤을 조심스럽게 제거하십시오. 잘 해리되지 않은 조직 덩어리가 균질화기의 바닥에 가라앉도록 하고 상청액을 냉각된 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그 후, 제거된 부피를 새로운 더닝 완충액으로 교체하고 총 3-4회 동안 또는 모든 조직이 해리될 때까지 해리 절차를 반복합니다.

이 절차에서는 세포 현탁액이 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 더닝 완충액을 추가하고 총 부피를 33.5밀리리