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신경과학
0 조회수 • 5:31 분 • July 8th, 2025
냉각된 뇌 매트릭스에서 마우스 뇌로 시작합니다.
뇌하 영역 또는 SCZ를 포함하는 절편을 얻습니다. 절편을 차가운 인산염 완충액으로 옮깁니다.
해부 현미경으로 SCZ 부분을 잘라냅니다.
해부된 SCZ를 더 작은 조각으로 자릅니다.
이 조각을 분해 완충액으로 옮깁니다. 조직에서 세포를 해리시키기 위해 배양합니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다. 세포를 적절한 배지에 재현탁합니다.
세포를 배양 플레이트로 옮기고 특정 성장 인자를 추가합니다.
성체 신경 줄기 세포는 분열하여 신경구라고 하는 클러스터를 형성합니다.
세포 클러스터의 부적절한 영양분 분포는 세포 성장을 제한합니다.
클러스터를 분산시키려면 원심분리하여 상층액을 버립니다. 클러스터를 해리 완충액에 재현탁하고 배양합니다.
용액을 위아래로 피펫팅하여 단일 세포를 생성합니다.
원심분리하여 상청액을 버립니다.
세포를 재현탁하고 적절한 배지로 옮겨 단층을 얻습니다.
해부되면 마우스 뇌를 차가운 PBS 완충액으로 옮기고 두 번 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다. 다음으로, 뇌를 얼음 위의 뇌 매트릭스에 놓고 관상 절단을 하여 1mm 두께의 조각을 얻습니다. 그 후, SCZ 영역을 포함하는 후방 뇌 절편을 차가운 PBS로 옮깁니다.
저배율의 해부 현미경으로 구부러진 30게이지 바늘로 피질과 해마의 백질 영역에서 SCZ를 미세 해부합니다. 그런 다음 SCZ 위의 피질 영역을 제거하고 해부된 SCZ를 얼음 위의 35mm 페트리 접시에 있는 차가운 PBS에 넣습니다.
뇌하 영역의 영역은 뇌 기질과 구부러진 30게이지 바늘을 사용하여 전체 조직에서 정밀하게 해부할 수 있습니다.
그런 다음 PBS를 제거한 다음 즉시 해부된 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 1밀리리터의 소화 완충액으로 재현탁하십시오. 그런 다음 샘플을 2밀리리터의 분해 완충액이 들어 있는 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.
이 단계에서 튜브를 가볍게 두드려 소화된 조직을 해리시킨 다음 튜브를 145배 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후, 상청액을 버리고 소화된 조직을 예열된 1밀리리터와 배지 2개로 재현탁하여 분해 완충액을 씻어낸 다음 샘플 용액을 최대 5회 부드럽게 피펫팅합니다.
다음으로, 샘플을 145배 g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포 펠릿을 1밀리리터의 N2 배지에 재현탁합니다. 코팅되지 않은 6웰 플레이트에 1밀리리터의 N2 배지를 넣고 부유 세포 1밀리리터를 추가하여 최종 부피 2밀리리터를 만듭니다.
다음으로, 각 웰에 밀리리터당 20나노그램의 EGF와 밀리리터당 20나노그램의 bFGF를 첨가합니다. 6웰 배양 접시를 손으로 부드럽게 흔들어 첨가된 성장 인자를 도금된 세포와 혼합합니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 보관합니다.
8일 동안 매일 각 웰에 밀리리터당 20나노그램의 EGF와 밀리리터당 20나노그램의 bFGF를 추가합니다. 3일마다 200마이크로리터의 N2 배지를 추가하여 약 2밀리리터의 배지를 유지합니다. 다음은 8일 후의 신경구 이미지입니다.
이 절차에서 신경구를 모아 새로운 15mm 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 145배 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상청액을 버리고 0.5밀리리터의 해리 완충액으로 신경구를 재현탁합니다. 섭씨 37도 수조에서 5분 동안 0.5밀리리터의 해리 완충액과 함께 배양하여 신경구를 단일 세포로 해리시킵니다.
샘플 용액을 위아래로 5회 미만으로 부드럽게 피펫팅하고 튜브를 145배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상청액을 버리고 신경구를 1밀리리터의 N2 배지로 재현탁합니다. PLL 라미닌으로 6웰 플레이트를 코팅한 후, 웰당 2밀리리터의 N2 배지로 밀리리터당 2.5 x 105셀로 세포를 도금합니다. SCZ 성체 신경줄기세포를 계대하기 전에 5일 동안 매일 성장 인자 처리로 유지합니다.