Single-Use Bioreactors를 사용하여 유도 만능 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오가노이드 생성

인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생물 반응기에서 시드합니다. iPSC는 세포 사멸 억제제를 포함하는 배지에 재현탁됩니다.

자기장 아래에서 생물반응기의 수직 휠은 제어된 속도로 회전하여 세포 간 접촉 및 응집체 형성을 촉진합니다. 대부분의 배지를 제거하고 억제제 없이 새 배지를 추가합니다.

계속

배양하십시오. 골재가 최적의 크기에 도달하면 중력에 의해 침전되도록 합니다. 매체를 제거합니다.

성장 인자를 포함하는 분화 배지를 추가하고 바이오리액터 휠 속도를 줄여 배양합니다. 성장 인자는 응집체 내에서 신경 분화를 촉진합니다.

다음으로, 소뇌 전구 세포의 발달을 유도하는 성장 인자와 케모카인이 보충된 신선한 배지를 추가합니다.

점차적으로 소뇌 전구세포는 응집체 내에서 뚜렷한 층으로 조직되어 초기 소뇌 오가노이드를 형성합니다.

마지막으로, 특정 신경영양 인자를 포함하는 신경 배지를 추가합니다.

이러한 요인은 소뇌 전구세포를 시냅스 활성 기능적 소뇌 뉴런으로 성숙시켜 성숙한 오가노이드를 생성합니다.

1일차에 0일차가 바이오리액터를 파종하는 날인 상태에서 바이오리액터와 베이스 유닛을 멸균 플로우 후드에 넣습니다. 그런 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액의 1밀리리터 샘플을 수집합니다. 세포 현탁액을 초저부착 24웰 플레이트에 플레이트합니다. 현미경을 사용하여 iPSC 유래 응집체가 형성되었는지 확인합니다. 그렇다면 40x 또는 100x에서 집계의 이미지를 캡처합니다.

응집체의 평균 직경이 100마이크로미터가 될 때까지 바이오리액터에서 iPSC를 계속 배양합니다. 그런 다음 배지의 80%를 ROCK 억제제가 없는 신선한 mTesR1로 대체합니다. 응집체가 직경이 200-250마이크로미터에 도달하면 모든 오가노이드가 생물반응기 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 사용한 모든 배지를 gfCDM 분화 배지로 교체합니다.

기본 장치와 바이오리액터를 인큐베이터에 넣고 교반을 25RPM으로 줄입니다.