쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

종양이 포함된 관류 마우스 뇌를 예로 들어 보겠습니다.

관류 단계는 순환하는 면역 세포를 제거하지만 종양 침윤 세포는 유지합니다.

종양이 포함된 조직을 분리합니다.

이제 조직을 기계적으로 해리시킵니다.

기계적 힘은 조직을 느슨하게 하여 세포를 방출합니다.

해리된 조직을 튜브로 옮깁니다.

파

편이 포함된 상청액을 원심분리하여 버립니다.

콜라게나제와 DNase를 함유한 소화 용액에 조직을 재현탁합니다.

콜라게나제는 세포외 기질을 분해하여 세포를 방출합니다. DNase는 오염된 DNA를 분해합니다.

효소 활성을 멈추기 위해 완충액을 추가합니다.

현탁액을 여과하여 세포 응집체를 제거하고 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

원심분리하여 상청액을 버립니다.

고밀도 그래디언트 배지에 세포를 재현탁합니다. 이제 저밀도 그래디언트 매체와 오버레이하여 명확한 인터페이스로 분리 그래디언트를 형성합니다.

분리 층으로 원심 분리합니다. 면역 세포는 구배 배지 사이의 경계면에 모이고 세포 파편은 그 위에 떠 있습니다.

추가 분석을 위해 면역 세포를 수집합니다.

이 절차에서는 깨끗한 외날의 면도날을 사용하여 뇌 중심을 시상 모양으로 절단하여 두 반구를 이등분하여 종양을 포함하는 뇌 영역을 분리합니다. 동측 반구 내측을 아래로 돌리고 소뇌에서 하나의 관상 절단을 하고 후각 구근에서 다른 절단을 하여 종양 임플란트가 포함된 표적 조직을 분리합니다.

다음으로, 표적 조직을 1밀리리터의 DPBS가 들어 있는 라벨이 부착된 유리 다운 조직 분쇄기에 넣습니다. 플런저를 끝까지 밀고 7번 비틀어 조직을 파괴합니다. 그런 다음 플런저를 들어 올려 액체가 티슈 그라인더 바닥으로 다시 가라앉도록 합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다. 그러나 뇌 조직이 과도하게 분쇄되는 것을 방지하기 위해 다음 두 번의 반복 동안 플런저를 네 번, 마지막 반복 동안 세 번만 비틀십시오.

그런 다음 플런저 측면에 얼음처럼 차가운 DPBS 1밀리리터 3개를 도포하여 잔여 뇌 물질을 조직 분쇄기로 헹굽니다. 그런 다음 분쇄된 뇌 물질을 위아래로 피펫팅하여 재현탁하고 얼음 위에 라벨이 붙은 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 얼음처럼 차가운 DPBS 1밀리리터로 DAPS 티슈 그라인더의 측면을 헹구고 동일한 15밀리리터 원심분리기 튜브에 추가합니다.

모든 샘플이 처리될 때까지 분쇄된 뇌 물질이 들어 있는 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 15밀리리터 원심분리기 튜브에서 분쇄된 뇌 물질을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 g으로 회전시킵니다. 다음으로, 상청액을 제거하고 펠릿화된 뇌 물질을 이전에 준비된 콜라게나제와 DNase I 소화 효소의 혼합물 1밀리리터에 재현탁합니다.

15밀리리터 원심분리기 튜브를 시험관 랙에 넣고 랙을 섭씨 37도의 수조에 15분 동안 넣은 다음 배양 기간 동안 튜브를 튕겨 조직 분해를 용이하게 하여 샘플을 두 번 부드럽게 교반합니다.

그런 다음 각 튜브에 얼음처럼 차가운 DPBS 6밀리리터를 첨가하여 소화 효소를 희석합니다. 위아래로 피펫팅하여 재현탁하고 멸균 70미크론 나일론 메쉬 필터를 통해 얼음 위의 새로운 라벨이 부착된 15밀리리터 원심분리기 튜브로 총 부피를 걸러냅니다.

그런 다음 뇌 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 g으로 회전시켜 단일 세포 펠릿을 얻습니다. 원심분리기에서 15밀리리터 튜브를 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 다음 단계를 준비하기 위해 원심분리기의 온도 설정을 섭씨 약 21도까지 높입니다.

다음으로, 세포 상청액을 완전히 제거하고 처음에 P1000 마이크로피펫을 사용하여 70% 밀도 원심분리 배지 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브에 70% 밀도 원심분리 배지 4밀리리터를 추가합니다. 캡을 단단히 씌우고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포 현탁액을 균질화합니다.

그런 다음 밀도 70% 원심분리 배지에 재현탁된 뇌 세포가 들어 있는 15밀리리터 원심분리기 튜브를 얼음에서 실온의 시험관으로 다시 옮깁니다. 한 번에 하나씩 2밀리리터의 37% 밀도 원심분리 배지 용액을 5밀리리터의 70% 밀도 원심분리 배지 용액에 조심스럽게 오버레이하여 두 밀도 원심분리 배지 층 사이에 깨끗한 인터페이스를 형성합니다.

그런 다음 두 층 사이의 계면 위치를 미세한 마커로 표시하여 원심분리 후 구별이 덜 분명해졌을 때 쉽게 식별할 수 있도록 합니다. 밀도 원심분리 배지 층 사이의 계면이 손상되지 않도록 실온에서 740배 g으로 20분 동안 15밀리리터 원심분리기 튜브를 중단 없이

회전시킵니다.

그 후, 지질 층을 조심스럽게 우회하여 P200 마이크로피펫을 튜브에 도입하여 두 밀도 원심분리 배지 층 사이의 계면에 축적된 PBMC를 수집합니다. PBMC 밴드 수준에 도달하면 70% 밀도 원심분리 배지 층의 표면에서 200마이크로리터를 천천히 추출하고 얼음 위에 각각 표지된 폴리프로필렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복하여 샘플당 총 부피 400마이크로리터를 달성합니다.