쥐 소뇌 과립 뉴런 배양에서 미세아교세포를 선택적으로 제거

수확한 쥐 소뇌를 가져다가 조각으로 자릅니다.

단편을 트립신이 들어 있는 튜브로 옮기고 배양합니다.

트립신은 조직의 세포외 기질을 소화하여 소뇌 과립 뉴런과 미세아교세포 및 성상세포와 같은 비신경 세포를 느슨하게 합니다.

트립신 억제제와 DNase를 포함하는 완충액을 추가합니다. 억제제는 트립신을 비활성화하고 DNase는 오염된 DNA를 분해합니다.

원심분리하여 상청액을 버립니다.

억제제와 DNase를 포함하는 완충액에 조직을 재현탁하고 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 형성합니다.

단백질 함유 완충 용액에 현탁액을 오버레이합니다.

세포 파편이 포함된 상청액을 원심분리하고 버립니다.

세포를 배지에 재현탁하고 세포 부착을 용이하게 하기 위해 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 시드합니다.

미디어를 제거합니다. 세포를 신선한 배지로 세척한 다음 신경교세포 증식을 방지하기 위해 세포 주기 억제제가 포함된 배지를 추가합니다.

배지의 절반을 리소좀 억제제가 포함된 신선한 배지로 교체합니다.

제는 미세아교세포를 선택적으로 표적으로 삼고 리소좀 막을 파괴하여 미세아교세포 사멸 및 배양에서 제거를 유발합니다.

4일에서 7일 된 쥐 새끼에게서 소뇌를 수집하여 이 절차를 시작합니다. 얼음 위에 5밀리리터의 용액 A가 들어 있는 페트리 접시에 즉시 넣으십시오. 그런 다음 소뇌에서 여분의 용액을 제거하고 페트리 접시 뚜껑에 조직을 넣습니다. 다음으로, 잘 타는 면도날로 티슈를 적어도 세 가지 방향으로 잘게 자릅니다.

그런 다음 다진 티슈를 용액 B에 첨가합니다. 섭씨 37도의 수조에 5분 동안 넣고 2분마다 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 튜브에 용액 D 20밀리리터를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 흔들어 65g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 붓습니다. 4밀리리터의 용액 C에 재현탁합니다.

현탁액이 가능한 한 균질해질 때까지 직경이 감소하는 3개의 화염 유리 피펫 각각으로 샘플을 10회 분쇄합니다. 다음으로, BSA-EBSS 위에 이 균질액 몇 방울을 천천히 부드럽게 추가합니다. BSA-EBSS를 통해 가라앉기 시작하면 더 분쇄하고 용액 C를 조금 더 추가합니다. 균질은 BSA-EBSS 위에 층에 위치해야 합니다.

100g에서 5분간 돌리고 흔들지 마십시오. 그런 다음 상청액을 제거하고 펠릿을 1밀리리터의 MEM 배지에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 500마이크로리터의 MEM 배지에 커버슬립당 800,000개의 세포로 플레이트합니다. 그런 다음 이산화탄소 6%가 포함된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 세포 주기 억제제인 AraC의 10마이크로몰을 포함하는 MEM 배지 용액을 만듭니다.

각 커버슬립에 대해 250마이크로리터의 기존 배지를 신선한 24웰 플레이트에 보관하고 나머지는 흡인합니다. 250마이크로리터의 일반 MEM 배지를 추가하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 오래된 배지를 세포에 다시 추가하고 250마이크로리터의 AraC 함유 배지를 채웁니다.

이 절차에서는 순수 LME를 MEM 배지 5밀리리터에 첨가하여 최종 농도 150밀리몰 LME를 제공합니다. 산-염기 용액을 사용하여 용액을 pH 7.4로 되돌립니다. 그런 다음 0.2마이크로미터 주사기 필터가 있는 28mm PES를 사용하여 멸균 여과합니다.

다음으로, MME 용액을 MEM 매질에서 50밀리몰 농도로 희석합니다. 그런 다음 대조군 배양을 위해 일반 MEM 배지와 함께 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣습니다. 10분 후, 각 CGC 배양액에서 250마이크로리터의 MEM 배지를 제거합니다. 그런 다음 미디어를 섭씨 37도에 유지합니다.

다음으로, 대조군 배양을 위해 LME의 2배를 포함하는 MEM 배지 또는 LME가 없는 예열된 MEM 배지로 세포를 처리합니다. 세포를 섭씨 37도에서 6% 이산화탄소가 함유된 가습 분위기에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 미리 예열된 신선한 MEM 배지에서 세포를 두 번 세척하여 LME 함유 배지를 제거합니다.

그런 다음 보존된 배양 배지를 같은 양의 신선한 예열된 MEM 배지로 교체합니다. 마지막으로, 배양물을 섭씨 37도에서 6% 가습된 이산화탄소에 배양합니다.