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쥐의 뇌에서 유래한 신경교세포의 부착 배양이 있는 마이크로플레이트를 가져 와십시오. 배양에는 성상세포, 미세아교세포 및 희소돌기아교세포가 포함되어 있습니다.
배지를 제거하고 효소 용액과 함께 배양하여 세포를 분리한 다음 튜브로 옮깁니다.
원심분리하여 세포 파편이 있는 상청액을 제거합니다. 세포를 따뜻한 배지에 재현탁합니다.
주사기를 사용하여 분쇄하여 세포 덩어리를 분해하고 스트레이너를 사용하여 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
광가교성 생체고분자, 가교제 및 세포외 기질 성분을 추가합니다.
커버슬립에 부착된 틀에 혼합물을 붓습니다. 혼합물을 고강도 빛에 노출시켜 가교를 유도하고 겔을 형성하고 신경교세포를 캡슐
화합니다.금형을 제거하고 커버슬립을 마이크로플레이트에 놓습니다. 따뜻한 배지를 추가하고 생리학적 조건에서 겔을 배양합니다.
세포는 지지 세포외 기질 내에서 증식하고 세포 네트워크를 생성하여 신경교세포의 3차원 배양을 확립합니다.
세포 캡슐화 24시간 전에, 2주간의 1차 배양에서 배지를 흡인하고 각 웰에 1밀리리터의 신선한 배지를 추가합니다. 세포 캡슐화 당일, 각 12웰 플레이트에 대해 12.5ml의 묽은 트립신과 25ml의 배지를 준비하고 수조에서 섭씨 37도까지 데웁니다. 그런 다음 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 12웰 플레이트의 각 웰에 약 1밀리리터의 희석된 트립신을 추가합니다.
합류 세포층이 플레이트에서 분리될 때까지 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 20-30분 동안 배양합니다. 배양 후 1밀리리터 피펫을 사용하여 분리된 세포를 회수하고 단일 부유 조각으로 나타나야 하며 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 동등한 부피의 배지로 희석하고 실온에서 2분 동안 200배 g으로 원심분리합니다.
원심분리 후, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 10밀리리터의 따뜻한 배지에 재현탁합니다. 피펫으로 세포를 5회 분쇄한 다음 200회 g에서 2분 동안 다시 원심분리합니다. 스핀 후, 상청액을 디캔팅하고 세포를 5밀리리터의 따뜻한 배지에 재현탁한 다음 세포를 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 18게이지 바늘이 달린 10밀리리터 주사기를 사용하여 세포 용액을 세 번 분쇄하고 40미크론 세포 체를 통해 현탁액을 새로운 원추형 원심분리기 튜브로 여과합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 세포 현탁액을 수집하고 따뜻한 배지에서 1-100으로 희석하고 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다.
캡슐화 단계까지 나머지 세포를 섭씨 37도 수조에서 배양합니다. 3D 하이드로겔의 각 식물 12웰 플레이트에 대해 12.5밀리리터의 나이브 배지와 12.5밀리리터의 컨디셔닝 배지를 따뜻하게 합니다. 그런 다음 식물 12웰 플레이트당 7mg의 HAMA를 계량하고 부피에 대해 2% 중량의 농도로 여과된 멸균 제품에 첨가합니다. HAMA가 완전히 용해될 때까지 20kHz에서 60분 동안 용액을 초음파 처리합니다.
초음파 처리하는 동안 TEA와 NVP의 개별 10% 용액을 준비합니다. 또한 멸균 PBS의 1밀리리터 분취량에 에오신의 1밀리몰 용액을 준비합니다. 그런 다음 각 12웰 플레이트에 대해 1 x 107 세포, 0.5% HAMA, PBS의 20% 기저층 혼합물, 0.1% TEA, 0.1% NVP 및 0.01밀리몰 에오신 Y의 최종 1.4 1.4밀리리터 혼합물을 만듭니다.
용액을 부드럽게 혼합한 후 1밀리리터 팁이 장착된 피펫을 사용하여 각 PDMS 몰드에 100마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 샘플을 밀폐된 상자에 담긴 고강도 녹색 LED 조명에 실온에서 5분 동안 노출시킵니다.
5분간의 녹색 LED 노출은 3D 젤을 형성하는 데 필수적입니다. 에오신 Y에 의해 도입된 빨간색은 투명해지고 반응의 종료를 나타냅니다.
다음으로, 12웰 플레이트의 각 웰에 따뜻하고 컨디셔닝된 배지 1밀리리터를 추가합니다. 엄지와 검지 사이에 각 커버슬립을 잡고 구부러진 핀셋을 사용하여 젤을 변위시키지 않고 PDMS 몰드를 천천히 벗겨냅니다. 곰팡이를 조절된 매체가 있는 우물에 넣으십시오.
금형을 제거하는 것이 가장 어려운 단계입니다. 젤이 빠지고 커버슬립이 파손되는 것을 방지하기 위해 최대한 주의해서 수행해야 합니다. 이것은 연습이 필요할 수 있습니다.
모든 금형을 플레이트의 웰로 옮긴 후 각 웰에 따뜻한 DMEM/F12 배지 1밀리리터를 추가합니다. 이미징하기 전에 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 2주 동안 배양합니다.