하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 성상세포 스캐폴드를 생성하는 In Vitro 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 3:49 분 • July 8th, 2025

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정의된 직경의 속이 빈 튜브로 구성된 마이크로 컬럼 보트가 들어 있는 배양 접시를 가져 가십시오.

하이드로겔로 만들어진 마이크로 컬럼은 건조를 방지하기 위해 완충액으로 채워져 있습니다.

입체 현미경 아래에서 완충액을 제거하고 세포외 기질의 구성 요소인 얼음처럼 차가운 콜라겐 용액을 추가합니다.

컬럼 수화를 유지하기 위해 접시의 내부 가장자리를 따라 배지를 도입합니다. 콜라겐이 중합되어 마이크로 컬럼 내부에 코팅을 형성할 수 있도록 생리학적 조건에서 배양합니다.

마이크로 컬럼 내부에 성상세포를 추가하고 인큐베이팅하여 콜라겐에 대한 성상세포 접착을 촉진합니다.

다음으로 접시에 배지를 채우고 생리학적 조건에서 유지하십시오.

마이크로 컬럼의 좁은 직경으로 인해 성상세포는 길이를 따라 확장되는 과정을 가진 양극성 형태를 얻습니다.

시간이 지남에 따라 성상세포는 자체 조립되어 조밀한 성상세포 과정 다발을 포함하는 3차원 스캐폴드를 형성합니다.

하이드로겔로 둘러싸인 성상세포 스캐폴드는 다운스트림 분석을 위해 준비되었습니다.

생물안전 캐비닛 내부에서 공동 배양 배지에 쥐 꼬리 I 형 콜라겐의 밀리리터당 1mg 용액을 준비한 다음 얼음 위에 놓습니다. pH가 7.2에서 7.4 범위에서 안정될 때까지 필요에 따라 산 또는 염기로 ECM 용액의 pH를 조정합니다. 마이크로 컬럼 보트를 집게를 사용하여 35 또는 60 밀리리터 페트리 접시로 옮깁니다. 안내를 위해 스테레오스코프를 사용하여 각 마이크로컬럼의 한쪽 끝에 마이크로피펫의 10마이크로리터 팁을 배치하고 흡입하여 DPBS의 내강과 기포를 비웁니다.

P10 마이크로피펫에 콜라겐 용액을 충전합니다. 각 마이크로컬럼의 한쪽 끝에 10마이크로리터 팁을 놓고 내강을 채울 수 있을 만큼 충분한 용액을 공급한 다음 마이크로컬럼의 양쪽 끝에 ECM 저장소를 피펫팅합니다. 모든 컬럼이 채워지면 컬럼이 마르지 않도록 페트리 접시 주위에 링으로 피펫 공동 배양 배지를 피펫팅합니다.

마이크로컬럼이 들어 있는 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 최소 1시간 동안 배양하여 세포를 추가하기 전에 콜라겐의 중합을 촉진합니다. 그런 다음 P10 마이크로피펫의 끝을 마이크로컬럼의 한쪽 끝에 놓고 약 5마이크로리터의 세포 용액을 내강으로 옮겨 채웁니다. 보트에 모든 마이크로컬럼을 파종한 후 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양하여 성상세포가 ECM에 부착되도록 합니다.

배양 기간이 지난 후, 파종된 마이크로컬럼이 포함된 접시에 35mm 또는 60mm 페트리 접시에 대해 각각 3밀리리터 또는 60밀리리터의 공동 배양 배지를 조심스럽게 채웁니다. 도금된 마이크로컬럼을 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 배양으로 유지하여 정렬된 성상세포 다발의 자체 조립을 촉진하며, 이는 6-10시간 후에 번들 케이블과 같은 구조를 형성해야 합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026