인간 만능 줄기 세포에서 유래 한 분화 된 뉴런 리플레팅

조밀한 뉴런 네트워크를 가진 인간 만능 줄기 세포 유래 분화 뉴런이 포함된 대형 배양 플레이트로 시작합니다.

이 뉴런을 온화한 단백질 분해 효소와 함께 배양하여 플레이트에서 분리하여 시트로 들어 올립니다.

지속적인 배양으로 효소는 세포 연결을 부분적으로 방해하여 신경 네트워크를 느슨하게 합니다.

효소 활성을 멈추기 위해 배양 배지를 추가합니다.

분리된 뉴런을 반복적으로 피펫팅하여 서로 분리합니다.

세포 스트레이너를 통해 뉴런을 필터링하여 세포 덩어리를 제거하고 개별 뉴런을 수집합니다.

심분리하여 상층액을 제거합니다. 성장 배지에 재현탁하십시오.

재도금을 위해 이러한 뉴런을 폴리머와 접착 단백질로 코팅된 멀티웰 플레이트에 시드합니다. 부착을 허용하기 위해 인큐베이팅하십시오.

뉴런은 생존 상태를 유지하기 위해 배지의 영양분을 활용합니다. 영양 수준을 유지하기 위해 배양 배지를 정기적으로 교체하십시오.

뉴런 성숙과 그들 사이의 연결 형성을 허용하기 위해 더 배양합니다.

PBS로 분화된 뉴런 플레이트를 부드럽게 헹구는 것으로 시작합니다. PBS를 플레이트 벽 아래로 분산시키고 세포를 파괴하지 않도록 세포에 직접 분산시키지 마십시오. 접시를 기울이면서 접시 가장자리에서 PBS를 흡인하고 세포에 닿지 않도록 주의하십시오.

10cm 플레이트당 최소 1밀리리터의 단백질 분해 효소를 바르고 세포를 인큐베이터에 40-45분 동안 되돌립니다. 배양하는 동안 위상차 현미경으로 뉴런을 확인하고 신경망이 플레이트에서 완전히 분리되어 부서지기 시작할 때까지 프로테아제 처리를 계속합니다. 뉴런이 분리되면 프로테아제 1밀리리터당 신선한 DMEM 배지 5밀리리터를 첨가하여 소화를 중지합니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 플레이트에 대해 세포를 부드럽게 분쇄하여 너무 많은 압력을 가하지 않도록 합니다. 100마이크로미터 메쉬를 통해 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 한 방울씩 걸러내고 추가로 5밀리리터의 신선한 DMEM 배지로 여과기를 헹굽니다.

탁상용 원심분리기를 사용하여 세포를 1,000배 g으로 5분 동안 회전시킵니다. 원심분리 후 원추형 튜브를 생물안전 캐비닛으로 되돌리고 대부분의 배지를 흡인하고 세포를 촉촉하게 유지하기 위해 250마이크로리터를 남깁니다. 세포를 2밀리리터의 신선한 DMEM 배지에 부드럽게 재현탁하고 5밀리리터 혈청학적 피펫 끝을 통과시킵니다.

마지막으로 튜브를 2-3회 뒤집습니다. 혈구계와 트리판 블루를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산한 다음 신선한 DMEM으로 세포를 원하는 농도로 희석합니다. 특정 세포주의 요구 사항에 따라 튜브에 적절한 보충제를 추가하고 원추형 튜브를 2-3회 기울여 세포를 부드럽게 혼합합니다.

24웰 플레이트에서 라미닌 코팅을 흡인하고 PBS로 한 번 헹굽니다. PBS를 흡인하고 응집을 방지하기 위해 8자 모양으로 각 웰에 세포 용액을 도포합니다. 세포 도금이 완료되면 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 설정된 인큐베이터로 되돌립니다.