미세유체 칩을 이용한 인간 iPSC 유래 운동 신경 오가노이드 개발

인간 유도만능줄기세포(iPSC)를 Rho-키나아제 억제제가 함유된 영양이 풍부한 줄기세포 배지에 담그십시오.

억제제는 세포에 들어가 Rho-키나아제 효소를 차단하여 세포사멸을 방지합니다.

세포는 영양분을 활용하여 증식하고 자발적으로 응집하여 스페로이드라고 하는 3차원 세포 클러스터를 형성합니다.

점차적으로 배지를 신경 유도 배지로 교체하십시오. 배지의 신호 조절제는 줄기 세포를 신경 세포로 분화시킵니다.

성장 인자가 풍부한 신경 배지로 교체하여 스페로이드 세포를 운동 뉴런으로 분화하고 운동 뉴런 스페로이드 또는 MNS를 형성합니다.

이 MNS를 성숙 배지를 포함하는 폴리머 코팅 미세유체 칩으로 옮깁니다.

배지의 신경 성장 인자는 축삭 또는 뉴런의 더 긴 돌출부를 자극하여 스페로이드에서 성장하고 칩의 마이크로채널을 통해 확장됩니다.

이것은 운동 신경 조직의 3차원 모델인 운동 신경 오가노이드를 형성합니다.

3D iPS 세포를 운동 뉴런으로 분화하도록 유도하기 위해, 10마이크로몰 Y27632가 보충된 100마이크로리터의 피더 및 무혈청 세포 배양 배지에 있는 96웰 U-바닥 플레이트의 적절한 수의 웰에 웰당 4 x 10 4 iPS 세포를 시드합니다.

다음날, 각 웰의 상청액을 10마이크로몰 SB-431542 및 100나노몰 LDN-193189가 보충된 100마이크로리터의 KSR 배지로 교체합니다. 2일과 3일에 상청액을 10마이크로몰 SB-431542, 100나노몰 LDN-193189, 5마이크로몰 DAPT, 5마이크로몰 SU-5402, 1마이크로몰 레티노산 및 1마이크로몰 평활화 작용제가 보충된 100마이크로리터의 KSR 배지로 교체합니다. 4일과 5일에 상청액을 10마이크로몰 SP-431542, 100나노몰 LDN-193189, 5마이크로몰 DAPT, 5마이크로몰 SU-5402, 1마이크로몰 레티노산 및 1마이크로몰 평활 작용제로 보충한 75% KSR 배지와 25% N2 배지의 혼합물로 교체합니다.

6일과 7일에 상청액을 50%의 KSR 배지와 50%의 N2 배지의 혼합물로 교체하고 5마이크로몰 DAPT, 5마이크로몰 SU-5402, 1마이크로몰 레티노산 및 1마이크로몰 평활 작용제로 보충합니다. 8일과 9일에 상청액을 5마이크로몰 DAPT, 5마이크로몰 SU-5402, 1마이크로몰 레티노산 및 1마이크로몰 평활 작용제로 보충한 25%의 KSR 배지와 75%의 N2 배지의 혼합물로 교체합니다. 10일과 11일