0 조회수 • 5:23 분 • July 8th, 2025
설치류의 뇌에서 얻은 뇌 절편을 가져 가십시오. 조각은 해마 뉴런을 포함하는 해마로 구성됩니다.
뇌 조각을 닭 혈장이 들어 있는 커버슬립으로 옮깁니다.
트롬빈과 혼합된 혈장을 슬라이스에 바릅니다. 트롬빈은 혈장 응고를 유도하여 커버슬립에 대한 슬라이스의 접착을 촉진하는 생물학적 스캐폴드를 생성합니다.
평평한 면에 구멍이 있고 튜브 외부의 구멍 주위에 접착 디스크가 부착된 평평한 롤러 튜브를 가져 가십시오.
커버슬립을 접착 디스크 위에 놓고 뇌 슬라이스가 튜브 내부를 향
하도록 합니다.튜브에 신경 배양 배지를 추가하고 이산화탄소와 공기 혼합물을 흐릅니다.
튜브에 뚜껑을 덮고 롤러 랙에 삽입한 다음 롤링 동작으로 배양합니다.
롤링 인큐베이션에 의해 제공되는 통기와 배지의 영양분은 뇌 절편의 장기 배양을 지원합니다.
시작하려면 롤러 튜브 랙을 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 롤러 튜브에 구멍을 뚫는 데 도움이 되는 지그를 만듭니다. 지그를 사용하여 평평한 면이 위를 향하도록 평평한 1cm 플라스틱 배양 튜브를 제자리에 고정합니다. 그런 다음 중앙이 바닥에서 1cm 떨어진 곳에 튜브 측면 사이의 중앙이 되도록 직경 6mm의 구멍을 뚫습니다.
회전 디버링 도구를 사용하여 구멍의 가장자리를 매끄럽게 하고 구멍의 안쪽 가장자리에 4개의 홈을 만들어 회전 중에 구멍의 배수를 용이하게 합니다. 그런 다음 튜브를 70% 에탄올로 헹구고 생물학적 안전 캐비닛에서 자연 건조시킵니다. UV 램프 아래에서 12mm 천공 접착 실리콘 고무 디스크에서 튜브를 40분 동안 멸균합니다.
20분 후 노출된 모든 표면이 멸균되도록 튜브와 디스크의 위치를 변경합니다. 다음으로 접착 디스크에서 흰색 뒷면을 떼어냅니다. 구멍을 정렬하고 실리콘 고무를 튜브 외부에 부착합니다.
조각이 얻어지면 준비된 커버슬립의 사진 에칭 면의 중앙에 2마이크로리터의 닭 혈장을 놓습니다. 플라즈마를 약간 펴서 직경 3-4mm의 스폿을 만듭니다. 그런 다음 멸균된 끝이 좁은 주걱을 사용하여 준비된 뇌 조각을 들어 올립니다. 닫힌 집게를 사용하여 슬라이스를 들어 올리는 동안 주걱 끝에 슬라이스를 유지합니다. 주걱을 커버슬립의 플라즈마 스팟에 대고 닫힌 집게를 사용하여 슬라이스를 커버슬립 위로 밀어 넣습니다.
슬라이스를 놓기 전에 커버슬립에 병아리 혈장을 얇게 층 바르고 슬라이스를 덮기 위해 최소한의 트롬빈 처리 혈장을 추가합니다. 슬라이스가 뜨면 혈전이 제거될 때 접착된 상태로 유지되지 않습니다.
다음으로, 2.5마이크로리터의 혈장과 2.5마이크로리터의 트롬빈을 별도의 튜브에 혼합합니다. 이 혼합물 2.5마이크로리터를 슬라이스 위와 주위에 빠르게 놓고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 이전에 롤러 튜브에 부착된 실리콘 고무 접착제의 노출된 면에서 투명한 플라스틱 덮개를 제거합니다. 그런 다음 브레인 슬라이스가 있는 커버슬립을 접착제 위에 놓고 슬라이스를 구멍 안에 정렬합니다.
접착력을 확보하기 위해 엄지손가락으로 커버슬립을 고르게 누르고 약 1분 동안 유지하면서 생물학적 안전 캐비닛으로 옮겨 커버슬립에 부드럽고 균일한 압력을 가합니다.
커버슬립을 누출 없이 튜브에 부착하기 위한 커버슬립에 가해지는 압력은 실란트의 공기 채널을 제거할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 유지되어야 합니다. 너무 많은 압력을 가하면 커버슬립에 금이 가게 됩니다.
생물학적 안전 캐비닛에서 0.8밀리리터의 완전한 신경기저 A 배양 배지를 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 5% 이산화탄소, 95% 공기 혼합물을 클램프로 단단히 고정된 멸균 면봉 목초지 피펫을 통해 흐르게 합니다. 이것을 사용하여 롤러 튜브를 가스 혼합물로 세척하고 튜브가 피펫 주변에서 빼낼 때 튜브를 빠르게 캡을 씌
웁니다.그런 다음 튜브에 슬라이스 번호와 랙 번호로 라벨을 붙입니다. 튜브를 롤러 랙에 삽입하여 기하학적으로 균형을 유지합니다. 튜브의 수가 홀수인 경우 균형을 맞추기 위해 빈 튜브를 추가합니다.
랙을 섭씨 35도의 롤러 인큐베이터에 놓고 롤러가 롤러 랙을 돌려 배지를 튜브 바닥에 유지합니다. 인큐베이터의 전면을 보드 위로 들어 올려 인큐베이터를 약 5도 뒤로 기울입니다.