빠른 신경관 확장 및 형성 시작기능적 신경 세포 연결

라이신으로 코팅된 접시 내에 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치를 조립하는 것부터 시작하십시오.

성장 배지가 있는 배아 뉴런을 미세유체 우물에 시드하여 마이크로채널을 통해 흐를 수 있도록 합니다.

배양하여 신경 부착 및 성장을 촉진하여 물리적으로 고립된 신경 집단을 형성합니다.

설정을 분해하고 세포 생존력을 유지하기 위해 식염수 흐름이 있는 미세 조작기 챔버에 접시를 놓습니다.

뉴런 근처에 라이신 코팅 비드를 도입하여 신경돌기 또는 세포 돌기가 부착되어 비드-신경돌기 복합체를 형성할 수 있도록 합니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 흡입을 가하여 한 채널에서 비드-신경돌기 복합체를 결합합니다.

이 복합체를 당겨 기계적 장력을 유도하여 빠른 신경돌기 확장을 유도합니다.

이것을 다른 비드-뉴런 복합체로 안내하고 두 번째 마이크로 매니퓰레이터로 잡습니다.

신경염 연결의 형성을 촉진하기 위해 두 구슬을 제자리에 유지하십시오.

흡입을 해제하고 식염수를 배양 배지로 교체하십시오.

인큐베이팅하여 뉴런 간의 기능적 연결을 설정하고 신경 전달 물질을 통한 의사소통을 촉진합니다.

우물을 비우지 않고 미세유체 장치의 상부 웰에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 농축 세포 용액을 미세유체 장치의 오른쪽 상단 웰에 넣고 세포가 단일 집단 미세유체 장치 내부에서 어떻게 흐르는지 현미경으로 확인합니다.

여러 집단의 장치에 세포를 플레이트하려면 농축된 세포 용액 20마이크로리터를 각 상단 웰에 추가합니다. 현미경으로 세포가 챔버 내부에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 기질에 대한 세포 부착을 촉진하기 위해 장치를 인큐베이터에 15-30분 동안 넣습니다.

세포가 기질에 부착된 후 단일 집단 장치의 두 상단 웰에 40마이크로리터의 NBM을 추가합니다. 이렇게 하면 마이크로채널에서 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다. 세포가 주입된 동일한 웰인 다중 집단 장치의 상단 웰에 20마이크로리터의 NBM을 추가합니다. 매체는 양의 메니스커스를 형성하기 위해 약간 돌출되어야 하며 우물에 머핀 상단 측면을 부여

미세유체 장치를 제거하기 1-2일 전에 각 샘플 접시에 예열된 NBM 2밀리리터를 추가하고 챔버를 가득 채웁니다. 그런 다음 장치를 인큐베이터에 보관하십시오. 그런 다음 멸균 핀셋과 피펫 팁을 사용하여 커버슬립에서 미세유체 장치를 제거하고 패턴화된 뉴런 구성을 남깁니다.

이 절차에서, 준비된 PDL 코팅 비드의 40-60마이크로리터를 세포 배양에 첨가한다. 그런 다음 시냅스 접촉의 형성을 촉진하기 위해 샘플을 1시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다. 그 후, 두 개의 마이크로피펫으로 세포를 위에서 평가하고 광학적으로 접근할 수 있도록 실험 설정에 샘플을 설치합니다. 이 구성에서 CCD 카메라는 이미지 캡처를 위해 현미경의 측면 포트에 있습니다. 식염수로 채워진 각 피펫을 1밀리리터 주사기에 연결합니다. 그런 다음 생리 식염수로 샘플을 관류합니다.

다음으로, 현미경으로 두 개의 분리된 신경 집단 사이의 간격을 확인하여 두 집단이 자연적으로 연결되어 있지 않은지 확인합니다. 시야에서 뉴런에 부착되지 않은 PDL 비드를 선택합니다. 비드에 초점을 맞춘 다음 마이크로피펫에 초점을 맞춰 비드를 마이크로피펫 팁에 맞춥니다.

그런 다음 현미경을 통해 모니터링하여 팁을 비드에 최대한 가깝게 내립니다. 그런 다음 피펫에 음압을 가하여 비드를 집어 올리고 실험 내내 음압을 유지합니다.

이제 시야에서 뉴런에 부착된 PDL 비드를 선택하고 흡입을 사용하여 두 번째 마이크로피펫에 부착합니다. 마이크로매니퓰레이터 또는 샘플 스테이지를 분당 0.5마이크로미터로 1마이크로미터 동안 천천히 움직여 PDL 비드-뉴런 복합체를 당기고 신경돌기 개시를 허용하기 위해 5분 동안 일시 중지합니다.

PDL 비드-뉴런 복합체를 2마이크로미터에 걸쳐 분당 0.5마이크로미터로 천천히 옆으로 움직여 당깁니다. 그런 다음 신경돌기가 신장되도록 5분 동안 멈춥니다. 처음 5마이크로미터 동안 성공적으로 시작하고 신경돌기를 확장한 후 분당 20마이크로미터로 신경돌기를 지속적으로 당깁니다.

뉴런을 연결하려면 신경돌기가 풍부한 영역을 선택하십시오. 다른 비드를 사용하여 커버슬립 위의 피펫 팁 높이를 측정하고 PDL 비드-신경돌기 복합체를 낮추어 신경돌기에 물리적으로 접촉하도록 합니다. 두 번째 마이크로피펫을 조작하는 동안 PDL 비드-신경돌기 복합체를 표적 신경돌기와 접촉시키십시오. 그런 다음 새로 형성된 신경돌기 위에 두 번째 PDL 비드가 있는 두 번째 피펫을 첫 번째 비드에서 약 20마이크로미터 떨어진 곳에 내리고 두 번째 PDL 비드를 사용하여 새로운 신경돌기 필라멘트를 표적 세포 쪽으로 밀어냅니다.

그런 다음 두 구슬을 최소 1시간 동안 제자리에 유지합니다. 현미경으로 비드와 접촉하는 신경돌기의 두꺼워짐인 국소 부종이 없는지 확인합니다. 이 시간 동안 샘플의 매질을 생리 식염수에서 예열된 이산화탄소 평형 NBM으로 천천히 변경합니다.

흡입을 풀어 두 번째 피펫에서 비드를 풀어줍니다. 새 신경돌기가 붙어 있는 상태로 남아 있으면 첫 번째 속도도 놓습니다. 그런 다음 샘플을 인큐베이터에 조심스럽게 다시 넣어 향후 실험을 위해 신경 연결을 강화합니다.