인간 피부 섬유아세포 리프로그래밍을 통한 뉴런 생성

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신경과학

0 조회수 • 3:32 분 • July 8th, 2025

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섬유아세포 배지에 현탁된 성인 인간 진피 섬유아세포 또는 aHDF를 세포외 기질 단백질 코팅 마이크로플레이트에 도입합니다. 세포 부착을 허용하기 위해 배양합니다.

형질전환 렌티바이러스 벡터를 도입합니다. 숙주 세포에 내재화되면 바이러스 RNA는 DNA로 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.

바이러스 DNA는 전사 인자와 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현합니다. 세포 뉴클레아제는 shRNA를 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 처리합니다.

생성된 siRNA는 전사 억제 인자를 암호화하는 mRNA를 분해하여 발현을 억제하고 신경 분화 유전자의 활성화를 가능하게 합니다.

전사 인자는 유전자를 활성화하여 aHDF의 신경 분화를 촉진합니다.

내재화되지 않은 벡터를 포함하는 배지를 제거합니다.

뉴런 유사 세포로의 분화를 유도하는 성장 인자와 소분자를 포함하는 초기 뉴런 전환 배지를 추가합니다.

배지를 뉴런으로의 성숙을 위한 신경영양 인자를 포함하는 후기 뉴런 전환 배지로 교체하십시오.

성숙한 뉴런은 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었습니다.

배지 밀리리터당 100,000개의 세포를 달성하기 위해 13.2밀리리터의 섬유아세포 배지에 1,320,000개의 세포의 세포 현탁액을 준비합니다. 플레이트에서 젤라틴을 흡인한 후 Dulbecco의 인산염 완충 식염수로 플레이트를 두 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

섬유아세포 배지 13.2밀리리터를 섭씨 37도까지 데웁니다. 그런 다음 실온에서 층류 후드에서 렌티바이러스 벡터를 해동합니다. 형질도입 강화제 없이 20의 감염 다중성으로 성인 인간 진피 섬유아세포를 감염시키는 데 필요한 양의 렌티바이러스를 배지에 추가합니다.

그런 다음 렌티바이러스 벡터를 첨가하여 배지를 500마이크로리터의 섬유아세포 배지로 교체합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 렌티바이러스를 함유한 배지를 렌티바이러스 벡터가 없는 신선한 섬유아세포 배지로 교체합니다. 바이러스 형질도입 후 3일째에 섬유아세포 배지를 제거하고 500마이크로리터의 초기 신경 전환 배지를 추가합니다.

일주일에 두 번 또는 세 번 각 웰에서 225마이크로리터의 오래된 배지를 250마이크로리터의 신선한 초기 신경 전환 배지로 교체합니다. 바이러스 형질도입 후 18일째에 초기 신경 전환 배지를 제거하고 후기 신경 전환 배지 500마이크로리터로 교체합니다. 25일째 또는 실험 종점까지 이전과 같이 2-3일마다 배지를 계속 교체합니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026