유기형 소뇌 절편 배양에서 Purkinje 세포 생존 분석

쥐 강아지 뇌부터 시작하십시오.

소뇌를 분리하고 적절한 두께의 조직 조각을 얻습니다.

배지가 들어 있는 배양 플레이트 웰 내에 배치된 멤브레인 인서트에 슬라이스를 옮깁니다.

처리된 우물에서 배지에는 신경 보호 테스트 화합물이 포함되어 있습니다. 제어 우물에는 화합물이 부족합니다. 인큐베이트.

통제 조건에서 소뇌 푸르킨제 세포는 세포사멸을 겪으며 생체 내에서 초기 출생 후 발달을 모방합니다.

처리된 우물에서 잠재력에 따라 화합물은 세포사멸로부터 세포를 보호할 수 있습니다.

슬라이스를 씻고 고정하여 세포 무결성을 보존합니다.

슬라이스를 투과화 차단 용액으로 옮겨 세포막을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.

푸르킨제 세포에서 특이적으로 발현되는 칼슘 결합 단백질을 표적으로 하는 1차 항체와 오버레이.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 접합 2차 항체를 세척하고 도입합니다.

DNA 결합 염료로 핵을 대조염색하고 슬라이스를 장착합니다.

공초점 현미경을 사용하여 생존 가능한 푸르킨제 세포를 정량화하여 테스트 화합물의 신경 보호 가능성을 확인합니다

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뇌를 채취하려면 곧은 드레싱 겸자를 사용하여 강아지 머리의 코를 잡고 곧은 눈 가위를 사용하여 두피를 뒷끝에서 정중선까지 옆으로 잘라냅니다. 같은 방법으로 두개골을 잘라서 소뇌가 손상되지 않도록 가위 끝을 바깥쪽으로 향하게 하고 주걱을 사용하여 차가운 HBSS와 포도당 밀리리터당 5mg이 들어 있는 60mm 접시에 뇌를 옮깁니다.

직선 드레싱 겸자를 사용하여 소뇌를 조심스럽게 해부하고 멸균 곡선 미세 겸자를 사용하여 조직 다지기의 절단 테이블에 있는 플라스틱 디스크에 조직을 놓습니다. 절단 테이블을 돌려 시상 주위 절편을 획득할 수 있도록 조직의 방향을 조정하고 테이블 해제 손잡이를 오른쪽으로 당겨 칼날이 조직 가장자리에 위치할 때까지 절단 테이블을 이동합니다. 그런 다음 슬라이스 두께를 350마이크로미터로 조정하고 블레이드 속도를 중간으로 조정하고 다지기를 시작합니다. 소뇌 전체가 잘리면 다지기를 끕니다.

멸균 겸자를 사용하여 디스크를 새 60mm 접시 위에 올려 놓습니다. 이송 피펫을 사용하여 HBSS와 포도당을 디스크 위로 세척하여 슬라이스가 접시에 떨어지도록 합니다. 그런 다음 샘플을 가능한 한 최소한으로 만지고 마이크로프로브를 사용하여 슬라이스를 분리합니다.

이송 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 개별 세포 배양 인서트에 대한 해충에 가까운 소뇌 섹션을 선택하고 마이크로프로브를 사용하여 슬라이스를 각 인서트의 중앙에 배치합니다. 모든 슬라이스가 배치되면 과도한 HBSS와 포도당을 조심스럽게 흡인하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

면역형광 염색의 경우 각 웰에서 상청액을 제거하고 삽입물을 PBS로 세척합니다. 각 인서트의 웰에 차가운 4% 파라포름알데히드 1밀리리터로 슬라이스를 고정하고 각 인서트 위에 500마이크로리터를 1시간 동안 고정합니다.

고정이 끝나면 각 인서트 아래에 1밀리리터의 신선한 PBS를 바르고 궤도 셰이커에서 세척할 때마다 각 인서트 위에 500마이크로리터의 신선한 PBS를 사용하여 인서트를 10분 동안 4회 세척합니다. 24웰 플레이트의 각 웰을 500마이크로리터의 PBS-TB로 미리 채우고 붓을 사용하여 각 세포 배양 삽입물의 소뇌 절편을 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.

슬라이스를 실온에서 1시간 동안 투과화하고 차단합니다. 배양이 끝나면, 안와 쉐이커에서 밤새 웰당 PBS-TB로 희석된 관심 1차 항체 200마이크로리터로 세포를 표지합니다.

다음날 아침, 슬라이스를 10분 동안 4회 세척하고 세척당 500마이크로리터의 신선한 PBS를 셰이커에서 세척한 후 빛으로부터 보호된 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 적절한 형광단 접합 2차 항체로 샘플을 라벨링합니다.

배양이 끝나면 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 웰당 500마이크로리터의 적절한 핵 염색으로 절편을 역염색하고 전사 피펫을 사용하여 슬라이스를 유리 슬라이드에 장착합니다.

그런 다음 PBS로 재수화하고 약 80마이크로리터의 마운팅 매체로 코팅된 커버슬립으로 조직을 마운트하기 전에 절편을 완전히 자연 건조시킵니다. 마운팅 매체가 경화되면 소뇌 절편을 이미지화할 준비가 됩니다.