Generating an Organoid Culture from a Brain Tumor Cell Suspension(뇌종양 세포 현탁액에서 오가노이드 배양 생성)

라미닌이 풍부한 세포외 기질 또는 lrECM이 포함된 미세 원심분리기 튜브로 시작합니다. 라미닌은 뇌에 풍부하게 존재하는 구조적 구성 요소입니다.

IrECM 중합을 방지하기 위해 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

뇌종양 세포를 첨가하고 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 완전히 혼합합니다.

다음으로, 혼합물을 파라필름 몰드에 옮겨 물방울을 형성합니다.

lrECM 중합을 촉진하여 세포의 자연 환경을 모방한 스캐폴드를 형성하기 위해 배양합니다.

이제 응고된 오가노이드를 배양 배지가 들어 있는 페트리 접시에 세척한 다음 배양합니다.

배양 배지는 필수 영양소와 성장 인자를 제공하여 세포 분열을 지원합니다.

오가노이드 내에서 세포는 이동 및 침입에 의해 자체 조직화됩니다.

배양 후 플레이트를 기울여 오가노이드를 침전시킵니다.

여분의 배지를 조심스럽게 제거하고 신선한 배지를 추가합니다.

부드럽게 흔들어 배양합니다.

이는 영양분을 고르게 분배하고 오가노이드 성장을 향상시킵니다.

단일 세포 현탁액에서 오가노이드를 만들려면 적절한 양의 라미닌이 풍부한 세포외 기질 또는 lrECM을 얼음통 또는 콜드 블록의 작은 원심분리기 튜브에 첨가합니다.

오가노이드당 20,000개의 세포를 포함하는 세포 혼합물을 준비합니다. lrECM 세포 현탁액 혼합물을 완전히 혼합하여 세포가 침전되지 않도록 하여 불균일한 오가노이드 형성을 초래합니다. 다음으로, 20마이크로리터의 혼합물을 파라필름 몰드에 조심스럽게 피펫팅하여 진주 같은 물방울을 형성합니다. lrECM 중합을 방지하기 위해 2-3개의 오가노이드마다 피펫 팁을 냉각시키십시오.

원하는 수의 오가노이드가 10cm 배양 플레이트의 파라필름 몰드에 피펫팅되면 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 오가노이드를 배양합니다. 오가노이드가 응고된 후, P1000 팁을 사용하여 NBMC 배지로 파라필름 몰드에서 오가노이드를 부드럽게 씻어내고 20밀리리터의 NBMC가 들어 있는 새로운 10센티미터 배양 플레이트에 수집합니다. 배양 플레이트를 4일 동안 흔들지 않고 인큐베이터에 넣습니다.

4일 후 플레이트의 미디어를 교체합니다. 이렇게 하려면 세포 배양 플레이트 아래에 어두운 종이를 놓습니다. 접시를 기울이고 20초 동안 기다립니다. 오가노이드가 접시 바닥에 완전히 가라앉으면 큰 개구부 유리 피펫으로 배지를 천천히 제거합니다.

새로운 배지를 추가한 후 플레이트를 인큐베이터에 80RPM의 궤도