0 조회수 • 4:08 분 • July 8th, 2025
부착된 기저막 매트릭스에서 배양된 인간 유도 만능줄기 세포 콜로니로 시작합니다.
특정 호르몬, 성장 인자 및 소분자 억제제를 포함하는 소뇌 분화 배지를 추가합니다.
유리 피펫을 사용하여 콜로니를 들어 올려 초저 부착 플레이트로 옮깁니다.
부착이 적은 표면은 세포를 현탁액으로 유지하여 세포가 3차원 배아체(EB)로 응집되는 것을 촉진합니다.
호르몬, 성장 인자 및 억제제는 각각의 표적 부위에 결합하여 줄기 세포가 신경 전구 세포로 분화하는 것을 촉진합니다.
EB 부착을 용이하게 하기 위해 합성 고분자와 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰로 EB를 옮깁니다.
배지를 억제제가 없는 분화 배지로 교체하십시오.
세포는 EB에서 바깥쪽으로 이동하기 시작하여 2D 단층을 형성합니다.
배지를 제거하고 소뇌 성숙 배지를 추가합니다.
배지의 성장 인자는 신경 전구세포를 뚜렷한 소뇌 신경 전구체로 성숙
시키도록 유도합니다.0일째에 10마이크로몰 Y27632를 보충한 소뇌 분화 배지 1밀리리터를 6웰 초저부착물 또는 ULA 플레이트의 각 웰에 SB431542하고, 들어 올린 콜로니가 웰에 추가될 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다. 당긴 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다. 배지를 흡인하고 각 35mm 접시에 대해 1밀리리터의 iPSC 계대 용액을 추가합니다.
섭씨 37도에서 3분 동안 배양한 후, 배지를 흡인하고 10마이크로몰 Y27632 및 SB431542가 보충된 소뇌 분화 배지 2밀리리터를 첨가합니다. 투과광 반전 현미경의 4X 배율에서 당긴 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 콜로니를 들어 올립니다. 모든 콜로니가 들어 올려지면 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 콜로니를 6웰 ULA 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다.
2일째에 각 웰에 FGF2를 첨가하여 밀리리터당 50나노그램의 최종 농도를 조정합니다. 7일째에 사용한 배지 1밀리리터를 흡인하고 신선한 소뇌 분화 배지 1밀리리터로 교체하여 배지의 1/3을 교체합니다. 배아체를 7일 동안 배양합니다.
14일째에 플레이트를 소용돌이치게 하여 플레이트 중앙에 모든 배아체를 모으십시오. 그런 다음 플레이트를 기울이고 가장자리에서 1000마이크로리터 피펫터를 사용하여 사용한 모든 배지를 흡인합니다. 배지의 양이 감소함에 따라 플레이트를 천천히 평평하게 놓고 배아체가 건조되지 않도록 충분한 배지를 남겨두고 계속 흡인합니다.
다음으로, 10마이크로몰이 보충된 신선한 소뇌 분화 배지 3밀리리터를 추가합니다. Y27632입니다. 그런 다음 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 배아체를 폴리-L-오르니틴 라미닌 코팅 접시로 옮깁니다. 15일째에 배지를 흡인하고 신선한 소뇌 분화 배지로 교체합니다.