Isolating and culturing murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors(쥐 소뇌 과립 뉴런 전구 세포)

쥐 강아지 대뇌를 예로 들어 보겠습니다.

더 작은 조각으로 균질화하십시오.

단백질 분해 효소를 첨가하여 조직의 세포외 기질을 소화하고 소뇌 과립 전구 세포(CGNP)와 성상세포를 느슨하게 합니다.

효소 활성을 멈추기 위해 혈청을 함유한 CGNP 배양 배지를 첨가하십시오. 효소가 풍부한 상청액을 원심분리하고 버립니다.

CGNP 배지에 조직 조각을 재현탁합니다. 조직을 기계적으로 해리시켜 세포를 방출합니다.

파편이 가라앉으면 세포가 포함된 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.

원심분리하고 파편이 있는 상층액을 제거합니다.

세포를 CGNP 배지에 재현탁하고 폴리-D-라이신으로 코팅된 멀티웰 플레이트 웰에 시딩합니다. 인큐베이트.

성상세포는 CGNP에 비해 폴리-D-라이신 코팅에 강하게 침착하고 부착됩니다.

플레이트를 흔들고 CGNP가 포함된 상청액을 수집합니다. 원심분리하여 상청액을 제거합니다.

CGNP를 CGNP 배지에 재현탁하고 폴리-L-오르니틴 코팅 멀티웰 플레이트에 시딩합니다. 인큐베이트.

CGNP는 코팅된 표면에 부착되어 배지 성분과 폴리-L-오르니틴의 도움을 받아 증식합니다.

3-5개의 소뇌를 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리하기 전에 HBSS 포도당으로 소뇌를 세척합니다. 튜브를 원심분리하여 조직을 수집합니다. 최종 세척 후, 조각이 0.5 내지 1입방 밀리미터 크기가 될 때까지 1밀리리터 피펫으로 위아래로 부드럽게 위아래로 2-3회 피펫팅하여 소뇌를 균질화합니다.

2.5밀리리터가 남을 때까지 모든 액체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 대뇌를 함유한 HBSS 포도당이 포함된 튜브에 0.05% 트립신을 첨가하고 조직을 섭씨 37도 수조에서 15분 동안 배양합니다. 1-3분마다 조직을 뒤집습니다. 배양 후 cGMP 세포 배양 배지 또는 CGM 5밀리리터를 첨가하여 소화를 중지하고 이전과 같이 원심분리하여 조직을 수집합니다.

원심분리 후 상청액을 제거하고 1밀리리터 CGM을 추가합니다. 기포 형성을 피하기 위해 1밀리리터 피펫 팁으로 조직을 분쇄합니다. 그런 다음 CGM 5밀리리터를 넣고 혼합물을 얼음 위에서 2분 동안 배양하여 조직 잔여물을 침전시킵니다. 조직이 침전되면 상청액을 새로운 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 잔여 조직에 CGM 2밀리리터를 첨가하고 분쇄 절차를 반복한 후 상청액을 채취하고 조직 잔여물을 버립니다.

15밀리리터 조직 튜브에서 상청액을 모으고 원심분리하여 소뇌 세포를 수집합니다. 펠릿을 10밀리리터의 CGM에 재현탁합니다. 성상세포는 cGMP보다 폴리-D-라이신에 더 빠르고 강하게 부착하기 때문에 폴리-D-라이신 코팅 6웰 플레이트의 웰에 최대 4밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 성상세포를 제거합니다.

접시를 흔듭니다. 상청액을 15밀리리터 튜브에 모은 다음 이전과 같이 상청액을 원심분리합니다. 펠릿을 10밀리리터의 CGM에 재현탁하고 Neubauer 계수 챔버로 세포를 계수합니다. 4-6시간 후, 부착된 cGMP는 둥글게 나타나고 증식합니다. 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트에 CGM의 세포를 시드하고 섭씨 37도, 5% CO₂ 및 100% 상대 습도에서 배양합니다.