인간 만능 줄기 세포에서 스페로이드 생성

배양 배지의 적절한 기질에 부착된 인간 만능 줄기 세포 또는 hPSC의 콜로니로 시작합니다.

매체를 제거합니다. 특정 억제제를 포함하는 신경 배지를 추가하고 배양합니다.

이러한 억제제는 hPSC의 성숙을 신경 계통으로 유도하여 신경 외배엽 콜로니를 형성합니다. 이들은 스페로이드라고 불리는 작은 구형 구조의 전구체입니다.

배지를 제거하고 소금 완충액으로 세척합니다.

소화 효소와 함께 배양하여 플레이트에서 콜로니를 분리합니다.

효소 활동을 중지하기 위해 신경 배지를 추가합니다.

식민지를 모아 튜브로 옮깁니다.

가라앉히도록 한 다음 상층액을 버립니다.

성장 인자를 포함하는 신경 배지에 콜로니를 재현탁합니다.

콜로니를 멀티웰 플레이트로 옮기고 배양합니다.

이 성장 인자는 신경외배엽 세포의 자기 조직화와 증식을 촉진하여 스페로이드를 형성하게 합니다.

시작하려면 60% 융합성에서 6웰 플레이트의 1웰에서 3개의 웰로 hESC 적격 기저막 매트릭스에 hPSC 콜로니를 도금하여 20%에서 30% 밀도를 달성한 다음 2D 신경외배엽 콜로니의 유도를 진행합니다.

이중 SMAD 억제제가 보충된 신선한 N2 배지를 다음 3일 동안 매일 각 웰에 추가합니다. 유도된 2D 신경외배엽 콜로니에서 3D 신경외배엽 스페로이드를 생성하려면 6웰 플레이트에서 2밀리리터의 N2 배지를 제거하고 HBSS로 한 번 세척하여 모든 N2 배지가 제거되도록 합니다.

각

콜로니 함유 웰에 1밀리리터의 디스파아제를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 20-25분 동안 배양하고 정기적으로 콜로니 박리를 확인합니다. 배양이 끝나면 디스파제 효소의 활성을 멈추기 위해 웰에 N2 배지 1밀리리터를 첨가합니다. 와이드 보어 P1000 피펫 팁 또는 멸균 가위가 있는 수정된 P1000 피펫 팁 컵을 사용하여 콜로니를 15밀리리터 튜브로 옮기고 콜로니 덩어리가 중력에 의해 튜브 바닥으로 가라앉도록 합니다.

그런 다음 표준 P1000 피펫 팁을 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 신선한 N2 배지 1밀리리터로 교체하고 분산효소를 완전히 제거하기 위해 세 번 세척을 반복합니다. 세포 덩어리와 N2 배지를 재현탁한 후, 세포 현탁액을 6웰 플레이트의 웰 1개로 옮기고 bFGF 밀리리터당 40나노그램을 첨가합니다.