출생 후 마우스 소뇌에서 줄기세포의 분리 및 신경 세포로의 분화

줄기 세포, 뉴런 및 아교세포를 포함하는 신생아 쥐 소뇌에서 분리된 세포를 취하십시오.

줄기 세포 특이적 표면 당단백질에 결합하는 항체 코팅 마그네틱 마이크로비드를 추가합니다.

원심분리하여 결합되지 않은 비드를 제거한 다음 세포를 완충액에 재현탁합니다.

세포가 흐르는 동안 마이크로비드 결합 줄기 세포를 유지하는 자기 분리기에 배치된 분리 컬럼에 세포를 로드합니다.

신경구 배지를 추가하여 세포를 용리하고 마이크로플레이트로 옮깁니다. 줄기 세포의 자가 재생 콜로니인 일차 신경구의 형성을 유도하기 위해 배양합니다.

심분리하여 배지를 버립니다. 세포 접착 단백질을 소화하기 위해 효소가 포함된 배지에 신경구를 재현탁합니다.

심분리하여 효소를 제거합니다. 신경구 배지를 추가하고 세포를 기계적으로 해리시킵니다.

줄기세포 증식과 2차 신경구 형성을 허용하기 위해 배양하는 반면, 줄기세포 특성이 없는 분화된 세포는 증식하지 않습니다.

신경구를 분화 배지로 옮기고 배양하여 뉴런과 아교세포로의 분화를 촉진합니다.

원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓은 다음 해리된 세포를 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 50밀리리터 튜브에 걸러냅니다. 필터 위에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액 10밀리리터를 올려 세포가 메쉬를 통과하도록 합니다.

여과된 세포를 신선한 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 g으로 원심분리합니다. 그런 다음 진공 흡인기를 사용하여 상청액을 완전히 제거합니다.

세포 펠릿을 160마이크로리터의 얼음처럼 차가운 마그네틱 컬럼 완충액에 재현탁합니다. 40마이크로리터의 항프로미니-1 마이크로비드를 세포 현탁액에 첨가합니다. 그런 다음 튜브를 냉장고에서 15분 동안 배양하여 항체가 프로미닌-1 발현 세포에 결합할 수 있도록 합니다.

1 내지 2 밀리리터의 컬럼 완충액 X로 세포를 세척하고 300 g 에서 10 분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 1밀리리터의 컬럼 완충액 X에 재현탁합니다. 마그네틱 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 500마이크로리터의 완충액 X로 한 번 헹굽니다. 표지된 세포 현탁액을 컬럼에 바르고 신선한 15밀리리터 튜브에 플로우스루를 수집합니다.

500마이크로리터의 완충액 X로 컬럼을 세 번 세척합니다. 그런 다음 자기장에서 컬럼을 제거하고 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. 배양 배지 1밀리리터를 넣고 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 프로미닌-1 비드로 태그된 세포를 씻어냅니다.

신경구를 통과시키려면 배양 배지와 함께 멸균 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 신경구를 300배 g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 상청액을 버립니다.

파파인 또는 0.05% 트립신 용액이 포함된 5밀리리터의 해리 배지에 펠릿을 재현탁하고 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 세포를 5밀리리터의 신경구 배지에 재현탁하고 목초지 피펫으로 천천히 위아래로 10회 피펫팅하여 해리시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 신경구 배지에 세포를 플레이트하고, 이전에 설명한 대로 배양에서 7일 내지 10일 후에 2차 신경구로 농축합니다.