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신경과학
0 조회수 • 3:24 분 • July 8th, 2025
망막 신경절 뉴런(RGN)을 포함하는 눈의 빛에 민감한 층인 쥐의 망막을 예로 들어 보겠습니다.
조직 손상을 방지하기 위해 망막을 차가운 균형 소금 용액에 넣으십시오.
망막을 프로테아제와 DNase가 포함된 용액에 옮기고 더 작은 조각으로 자릅니다.
내용물을 튜브로 옮기고 배양합니다.
프로테아제는 세포외 기질을 분해하고 세포를 느슨하게 하는 반면, DNase는 오염된 DNA를 분해합니다.
세포 덩어리를 분산시키기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
프로테아제 작용을 중지하기 위해 억제제 용액을 추가합니다.
세포를 원심분리하여 침전시킵니다. 상청액을 제거하고 세포를 적절한 성장 배지에 재현탁합니다.
이 세포 현탁액을 신경교세포의 일종인 후각 보호 신경교세포 또는 OEG 세포의 단층에 첨가하고 배양합니다.
RGN은 OEG 단층에 통합되어 OEG의 신경재생 잠재력을 평가하기 위한 공배양 모델을 확립합니다.
5밀리리터의 차가운 EBSS와 함께 미리 준비된 P-60 세포 배양 접시에 망막을 놓습니다. 그런 다음 재구성된 파파인과 50마이크로리터의 APV 및 250마이크로리터의 DNase와 5마이크로리터의 APV가 포함된 P-60 세포 배양 접시로 옮깁니다.
메스로 망막을 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 15밀리리터 플라스틱 튜브에 옮기고 10분마다 교반하는 5% 이산화탄소 아래에서 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 유리 파스퇴르 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 200배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.
상청액을 버리고 150마이크로리터의 DNase 및 30마이크로리터의 APV와 함께 알부민 오보무코이드 프로테아제 억제제에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
조심스럽게 알부민 오보무코이드 프로테아제 억제제 5밀리리터에 세포 현탁액을 첨가하고 원심분리를 반복합니다. 원심분리하는 동안 OAG 24웰 플레이트에서 ME-10 배지를 완전히 제거하고 웰당 500마이크로리터의 NBB-27 배지로 교체합니다.
상청액을 버리고 세포를 NBB-27 배지 2밀리리터에 재현탁합니다. 100마이크로리터의 망막 세포 현탁액을 M24 플레이트의 각 웰에 PLL 처리 또는 OEG 단층 커버슬립에 도금합니다.
NBB-27 배지에서 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양액을 96시간 동안 유지합니다.
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