0 조회수 • 3:49 분 • July 8th, 2025
쥐 머리 근육으로 시작하여 조각으로 자릅니다.
단백질 분해 효소 칵테일을 넣고 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
효소는 조직의 세포외 기질을 소화하여 근육 섬유를 느슨하게 합니다.
효소를 비활성화하기 위해 혈청 단백질이 포함된 배지를 첨가합니다.
조직을 튜브로 옮기고 원심분리한 다음 상청액을 버립니다.
조직을 배지에 재현탁합니다. 기계적 파괴와 원심분리를 두 번 반복하여 근육 복구 및 재생에 중요한 줄기 세포인 위성 세포의 균질한 현탁액을 얻습니다.
위성 세포 함유 상청액을 수집합니다.
세포 여과기를 통과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 배지에 재현탁합니다.
세포 현탁액을 세포외 기질 단백질 코팅 챔버 슬라이드 웰에 떨어뜨립니다.
코팅된 표면은 위성 셀 부착을 용이하게 합니다. 웰에 배지를 추가합니다.
배지의 성장 인자는 위성 세포의 증식과 근육 세포 전구체인 근모세포로의 분화를 유도하며, 근모세포는 더욱 증식하고 융합하여 다핵 근관을 형성합니다.
근관은 결국 근육 섬유로 성숙합니다.
위성 세포를 분리하려면 각 근육을 6웰 플레이트의 개별 웰에 옮기고 근육을 너무 많이 다지지 않도록 주의하면서 조직을 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 조직 조각을 웰당 2.5밀리리터의 0.1% 프로나제 용액에 섭씨 37도에서 60분 동안 20분마다 부드럽게 흔들면서 조심스럽게 배양합니다.
섬유 다발이 느슨한 모양을 보이면 말 혈청과 항생제가 보충된 DMEM 2.5밀리리터를 각 웰에 추가하고 소화된 조직을 개별 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직 슬러리를 회전시키고 상청액을 디캔팅합니다. 그런 다음 각 튜브에 5밀리리터의 배지를 추가하고 10밀리리터 플라스틱 피펫으로 조직을 균질화합니다.
조직을 다시 회전시키고 상청액을 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브에 5밀리리터의 배지를 더 추가하고 조각이 피펫을 쉽게 통과할 때까지 조직 조각을 다시 분쇄합니다.
또 다른 원심분리 후, 상청액을 적절한 해당 튜브에 풀링하고 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 개별 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 최대 세포 회수를 위해 1밀리리터의 DMEM으로 스트레이너를 세척합니다. 그런 다음 세포를 회전시킵니다. 펠릿을 신선한 배지에 재현탁하고 세포 수를 계산합니다.
분리된 위성 세포를 배양하기 위해, 다음으로, 세포 현탁액을 배양 배지 10마이크로리터당 1.5 x 103 세포로 희석한다. 그런 다음 이전에 준비된 각 세포외 기질 겔 스팟에 10마이크로리터의 세포를 추가하고 겔을 섭씨 37도에서 배양합니다. 6시간 후, 각 젤 스팟에 400마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 추가하고 슬라이드를 인큐베이터로 되돌립니다. 3일 후, 적절한 배양 배지를 첨가하여 세포의 분화를 시작합니다.