JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 4:02 분 • July 8th, 2025
다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 마우스 배아 암 세포 현탁액을 가져 가십시오.
배지와 레티노산이 들어 있는 소수성 배양 접시에 세포를 종자합니다.
인큐베이트. 소수성 표면은 세포 접착을 방지하여 세포가 응집체를 형성하도록 합니다.
레티노산은 세포 응집체에 들어가 신호 전달 경로를 유발하고 신경 전구 세포로의 분화를 일으킵니다.
배양 후, 세포 응집체를 수집합니다.
미디어를 버립니다.
레티노산이 함유된 배지를 첨가하고 응집체를 소수성 배양 접시에 시드합니다.
인큐베이트. 레티노산은 뉴런으로의 지속적인 세포 분화를 촉진합니다.
애그리게이트를 수집하고 미디어를 제거합니다.
단백질 분해 효소를 첨가하여 응집체 내의 세포-세포 접착을 방해합니다.
효소 활성을 멈추기 위해 혈청이 함유된 배지를 추가합니다.
응집체를 기계적으로 해리시켜 신경 현탁액을 형성합니다.
효소가 풍부한 상청액을 원심분리하고 버립니다.
뉴런을 배지에 재현탁하고 배지가 포함된 부착성 멀티웰 플레이트에 시드합니다.
인큐베이트. 뉴런은 판에 부착되어 성숙하여 긴 돌출부를 확장합니다.
응집체 생성을 위해, 100밀리리터의 미처리 배양 접시에 5마이크로리터의 RA가 보충된 10밀리리터의 분화 배지를 첨가하는 것부터 시작한다. 배양접시에 100만 개의 세포를 파종하고 응집체 형성을 촉진하기 위해 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2일 동안 배양합니다.
배양 후 10밀리리터 피펫을 사용하여 응집체가 포함된 배지를 흡인하고 실온에서 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 응집체가 바닥에 가라앉을 때까지 1.5분 동안 기다린 다음 상청액을 버립니다.
0.5마이크로몰 RA가 보충된 신선한 분화 배지 10밀리리터를 추가합니다. 새로운 100mm 처리되지 않은 배양 접시에 응재체를 부드럽게 파종하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 이틀 동안 배양합니다.
시작하려면 10밀리리터 피펫을 사용하여 세포 응집체를 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 응집체가 바닥에 가라앉을 때까지 실온에서 1.5분 동안 기다린 다음 상청액을 버립니다. 혈청 및 항생제가 없는 DMEM으로 응집체를 세척합니다. 세포 응집체가 바닥에 가라앉을 때까지 기다리십시오. 상층액을 버리고 0.25% 트립신 EDTA 2밀리리터를 추가합니다.
튜브를 섭씨 37도의 수조에서 10분 동안 배양하고 세포를 현탁 상태로 유지하기 위해 2분마다 두드립니다. 그런 다음 트립신 활성을 멈추기 위해 유지 배지 4밀리리터를 추가하고 1밀리리터 피펫을 사용하여 위아래로 20회 피펫팅합니다.
마지막으로 세포를 200배g과 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 5밀리리터의 유지 배지에 다시 현탁합니다. 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 결정하고 셀 도금을 진행합니다. 세포를 플레이트화하려면 먼저 웰당 3밀리리터의 유지 배지를 6웰 배양 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 웰당 500,000개의 밀도로 세포를 시드합니다. 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양합니다.