레티노산을 이용한 배아체세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors)를 이용한 신경전구세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors Using Retinoic Acid)

줄기 세포를 미분화 상태로 유지하는 섬유아세포 피더 세포 층 위에 배양된 배아 줄기 세포로 시작합니다.

트립신 효소와 EDTA를 첨가하여 세포 간 접착을 방해하고 세포를 분리합니다.

나중에 혈청이 풍부한 배양 배지를 추가하여 효소 활성을 멈추고 세포 현탁액을 튜브로 옮깁니다.

원심분리하여 세포를 수집하고 상청액을 제거한 다음 세포를 레티노산이 포함된 배지에 재현탁합니다.

이 세포 현탁액의 액적을 비접착성 배양 접시의 바닥에 놓습니다.

베이스를 뒤집어 매달린 방울을 형성하고 방울이 건조되는 것을 방지하기 위해 완충액으로 채워진 배양 접시 뚜껑 위에 놓습니다.

매

달린 물방울에서 중력은 세포를 바닥에 가라앉히게 하여 결국 배아체라고 하는 3차원 구조로 응집합니다.

또한, 세포는 다양한 세포 내 신호 전달 경로를 조절하는 레티노산을 흡수합니다.

이 조절은 줄기 세포가 뉴런 생성 능력을 가진 신경 전구 세포로의 분화를 자극합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2-5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 배아 줄기 세포를 수확하여 배아체 형성을 시작합니다. 신선한 Iscove's Modified Dulbecco's 배지 또는 15% FBS가 함유된 IMDM을 분리된 세포에 첨가한 다음 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

실온에서 160 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계산하고 0.5마이크로몰 레티노산이 있는 IMDM에서 밀리리터당 5 x 10⁵ 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 8채널 피펫과 200마이크로리터 팁을 사용하여 100밀리리터 페트리 접시당 120마이크로리터 방울을 도금합니다. 접시를 뒤집고 거꾸로 된 뚜껑에 PBS를 채워 매달린 방울이 마르는 것을 방지합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3-4일 동안 배양합니다.