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신경과학
0 조회수 • 4:27 분 • July 8th, 2025
성장 배지에서 1차 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)의 부착 배양물을 취합니다.
대조군 렌티바이러스 벡터를 대조군 웰에 추가하고 수초화를 조절하는 신호 전달 단백질을 암호화하는 테스트 벡터를 테스트 웰에 추가한 다음 배양합니다.
세포는 벡터를 내재화하고 바이러스 RNA는 DNA로 역전사되어 숙주 게놈에 통합되어 테스트 세포에서 신호 단백질을 발현합니다.
효소를 도입하여 기질에서 OPC를 분리합니다.
효소를 중화하고 원심분리하여 효소를 제거합니다.
성장 배지를 추가하고 OPC를 후근 신경절 또는 DRG 뉴런이 부착된 마이크로플레이트 내부의 커버슬립에 옮깁니다. OPC가 정착되도록 합니다.
우물을 성장 배지로 채우고 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 OPC를 희소돌기아교세포로 성숙시킵니다.
발현된 신호 전달 단백질은 희소돌기아교세포가 DRG 뉴런 주위에 수초를 형성하도록 유도합니다.
대조군 벡터 형질도입 세포와 비교하여 테스트 세포에서 신호 전달 단백질 유도 수초초 형성을 평가합니다.
이 프로토콜의 경우, CNTF, PDGF, NT3 및 Forskolin과 같은 성장 인자를 포함하는 10밀리리터의 SATO 배지가 있는 10cm 플레이트에서 1차 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)를 배양합니다. 세포는 8% 이산화탄소 아래에서 24시간 동안 배양되어야 합니다.
미디어를 흡인하는 것부터 시작하여 완전히 제거합니다. 그런 다음 성장 인자와 동일한 배지 10밀리리터로 교체하십시오. OPC를 렌티바이러스로 감염시키고, 필요한 양의 바이러스를 배지에 적가하여 관심 단백질을 발현합니다.
또한 별도의 OPC 플레이트에서 GFP만 발현하는 대조군 렌티바이러스를 배지에 혼합합니다. 세포를 48시간 더 배양한 다음 배양된 DRG 뉴런에 파종하기 위해 플레이트에서 OPC를 수집합니다.
먼저 각 플레이트를 8밀리리터의 EBSS로 두 번 헹굽니다. 1밀리리터의 트립신-EDTA 0.05%를 9밀리리터의 따뜻한 EBSS로 구성합니다. 각 플레이트에 희석된 트립신 5밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 최대 2분 동안 배양합니다. EBSS에 30% FBS 5밀리리터를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
그런 다음 10밀리리터 피펫을 사용하여 플레이트 표면에서 OPC를 세척합니다. 매번 플레이트를 1/4바퀴 돌려 모든 세포를 수집합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 실온에서 180g에서 15분 동안 원심분리합니다.
이제 상청액을 흡인하고 성장 인자가 없는 따뜻한 SATO 배지 밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 세포 수를 계산합니다. 다음으로, 플레이트에서 배지를 완전히 흡인하여 22mm 커버슬립에서 배양된 DRG 뉴런을 준비합니다.
그런 다음 200,000개의 OPC를 각 커버슬립에 적가하여 부드럽게 시드합니다. 파종량은 커버슬립당 200마이크로리터 미만이어야 합니다. 플레이트를 움직이지 않고 세포가 가라앉도록 합니다. 10분 후, 따뜻한 SATO 배지 밀리리터를 각 웰 위에 얹습니다. 이제 나머지 자매 OPC를 성장 인자를 포함하는 SATO 배지로 다시 도금합니다. 나중에 관심 단백질의 발현을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.