쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런 분리

형광 단백질 발현 뉴런을 포함하는 형질전환 마우스 피질을 취하십시오.

샘플 홀더에 고정합니다.

조직의 생리적 상태를 유지하기 위해 산소가 공급된 aCSF가 들어 있는 진동 절개 트레이에 홀더를 장착합니다.

설정된 매개변수를 사용하여 관상 슬라이스를 얻습니다.

슬라이스를 산소화된 aCSF와 활동 차단제가 포함된 메쉬 홀더에 넣어 안정화합니다.

슬라이스를 프로테아제로 처리하여 세포외 기질을 소화하고 세포를 느슨하게 합니다.

프로테아제를 제거하기 위해 aCSF로 세척합니다.

슬라이스를 aCSF와 혈청이 있는 배양 플레이트로 옮깁니다.

형광 현미경으로 형광 뉴런을 포함하는 슬라이스 영역을 해부합니다.

해부된 조각을 aCSF와 혈청이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

조직을 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 형성합니다. 세포를 aCSF가 들어 있는 배양 플레이트로 옮깁니다.

형광 현미경에서 모세관 피펫을 사용하여 형광 뉴런을 수집합니다.

추가 분석을 위해 이러한 뉴런을 aCSF가 포함된 배양 플레이트에 분배합니다.

안락사된 쥐의 뇌를 작은 가위로 두개골을 열고 피질을 손상시키지 않고 미세한 집게를 사용하여 신선한 뇌를 추출합니다. 뇌를 차갑게 산소가 공급된 aCSF에 넣고 절편 전체 기간 동안 5% 이산화탄소 균형 산소에 부착된 에어 스톤을 남겨둡니다.

진동 세포자 척에 뇌를 배치하고 300미크론 두께의 관상 또는 시상 절편을 절단합니다. 최소 10-50개의 표지된 세포를 얻기 위해 필요한 만큼의 절편을 수집합니다. 비커 안에 놓인 면 메쉬 슬라이스 홀더에 슬라이스를 올려 산소가 함유된 aCSF에 담그도록 합니다.

활성 차단제가 있는 aCSF가 들어 있는 비커에 슬라이스를 옮기고 에어 스톤을 사용하여 산소를 거품으로 일으키면서 실온에서 15-20분 동안 차단합니다. 슬라이스를 프로테아제 용액과 함께 aCSF가 들어 있는 비커로 이동하여 실온에서 온화한 소화를 수행합니다. 소화 후, 실온에서 5-10분 동안 활성 차단제 용액과 함께 aCSF가 들어 있는 비커로 슬라이스를 다시 이동하여 프로테아제를 씻어냅니다. 계속 산소를 거품으로 일으키십시오.

다음으로, 실온에서 1% FBS가 포함된 aCSF가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비하고 개별 절편을 미세 해부를 위해 접시로 옮깁니다. 형광 해부 범위에서 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 최소 10-50개의 세포가 있는 관심 영역과 층을 미세 해부합니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 미세 해부된 조각을 aCSF 용액에 약 0.8밀리리터의 1% FBS가 들어 있는 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온에서 미세분리기 튜브에서 해부된 조직을 분쇄합니다.

화염이 있는 각 파스퇴르 피펫으로 가장 큰 것부터 시작하여 가장 작은 출구 직경으로 끝나는 약 10번의 스트로크를 수행합니다. 해리된 세포를 산소화된 aCSF가 들어 있는 100밀리리터 페트리 접시에 분배하고 세포가 점차적으로 침전될 때까지 5-7분 동안 기다립니다.

해부 현미경으로 GFP 및 RFP 신호를 관찰합니다. 명시야 조명 하에서 형태를 검사하여 파편을 식별합니다. 파편이 거의 없는 세포 영역이 확인되면 모세관과 부착된 튜브를 사용하여 혀로 튜브 밸브 끝을 막아 세포를 선택합니다. 그런 다음 모세관을 세포 가까이에 배치합니다. 모세관의 블록을 풀고 다시 빠르게 차단하여 모세관 작용을 사용하여 세포를 포획합니다.

세관을 신선한 산소 aCSF가 있는 100mm 페트리 접시로 옮기고 형광 광학 장치에서 모세관 끝을 관찰하면서 튜브에 부드럽게 불어넣어 세포를 접시에 분배합니다. 100-150개의 세포가 수집될 때까지 수집 절차를 반복하여 명시야 미분 간섭 대비 광학에서 파편과 같은 오염 물질이 최소화되었는지 확인합니다.