$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
쥐 강아지 피질을 예로 들어 보겠습니다.
조직의 세포외 기질을 소화하는 단백질 분해 효소를 첨가하십시오. 그런 다음 조직을 기계적으로 해리시켜 세포를 느슨하게 합니다.
신경교 배지와 DNase를 첨가하여 오염된 DNA를 분해합니다.
조직을 기계적으로 해리시켜 뉴런과 신경교세포를 방출합니다.
소화되지 않은 조직이 가라앉으면 세포가 포함된 배지를 수집하고 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다.
세포를 아교세포 배지에 재현탁하고 세포외 기질 단백질 코팅 플라스크에 도금합니다.
인큐베이트. 성상세포는 다른 세포보다 코팅된 표면에 더 강하게 부착됩니다. 신경교 배지는 신경교세포 생존만을 촉진합니다.
미디어를 교체하여 이물질을 제거합니다.
위에 있는 희소돌기교 세포 전구체 세포, OPC 및 미세아교세포를 분리하기 위해 진영하면서 배양합니다.
세포가 있는 배지를 배양 플레이트로 옮깁니다.
차등 미세아교세포 접착을 촉진하기 위해 흔들면서 배양합니다.
비부착성 OPC 상청액을 폴리-D-라이신 코팅 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. OPC 순응도를 위해 배양합니다.
미디어를 OPC 미디어로 교체하여 OPC 성장을 허용합니다.
0.53밀리몰 EDTA와 함께 0.05% 트립신 1밀리리터를 조직이 있는 각 튜브에 추가합니다. 10밀리리터 피펫으로 혼합물을 약 20회 분쇄합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 빈 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
용액을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 15분 동안 배양하고 8분 후에 용해물을 부드럽게 교반합니다. 배양 후, 5밀리리터의 MGM과 200마이크로리터의 DNase-I를 각 튜브에 첨가하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 각 용해물을 10밀리리터 피펫으로 10회 분쇄합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 그대로 두어 해리되지 않은 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 세포 현탁액을 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 해리되지 않은 조직을 남깁니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 MGM 5밀리리터에 재현탁하고 20회 분쇄합니다.
코팅된 T-25 플라스크에 세포 현탁액을 도금하고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다. 희소돌기아교세포 전구체 세포 분리를 수행하려면 세포를 15시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 플라스크에서 상청액을 제거하고 멸균 페트리 접시에 접시합니다.
상청액을 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 30분 동안 배양하고, 15분 후에 소용돌이치며 남은 미세아교세포를 제거합니다. 비부착성 세포 상청액을 제거합니다. 세포의 수를 계산하고 원하는 농도로 폴리-D-라이신 코팅 표면에 도금합니다.
세포를 최소 1시간 동안 인큐베이터에 되돌립니다. 그런 다음 배지의 95%를 부드럽게 흡인하고 따뜻한 OPC 배지를 천천히 추가하여 OPC 파괴를 최소화하기 위해 웰 벽에 대고 피펫팅합니다.