인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오가노이드를 생성하는 기술

지지 매트릭스에서 배양된 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 콜로니를 취합니다.

배지를 흡인하고 매트릭스를 분해하는 효소를 첨가합니다.

효소를 제거하기 위해 씻으십시오. 그런 다음 배지와 피펫을 추가하여 느슨한 콜로니를 제거하고 더 작은 클러스터로 나눕니다.

클러스터를 신선한 배지로 옮기고 배양하여 클러스터가 구형 응집체를 형성할 수 있도록 합니다.

구체가 가라앉도록 하고 죽은 세포를 제거하십시오.

세포 증식을 위해 염기성 섬유아세포 성장 인자 또는 bFGF를 포함하는 배지와 함께 배양합니다.

세포 분화를 촉진하기 위해 점진적으로 감소하는 bFGF 농도를 포함하는 배지를 보충합니다.

신경 유도 배지를 도입하여 hESC를 신경 줄기 세포 또는 NSC로 분화하고 구체를 신경 로제트 유사 구조를 나타내는 오가노이드로 변환합니다.

장기간 배양하는 동안 오염된 미생물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 첨가하십시오.

NSC는 뉴런과 아교세포로 분화하여 오가노이드를 뇌 피질과 유사한 복잡한 구조로 점진적으로 발달시킵니다.

hESC의 각 6웰 플레이트에 대해 1밀리리터의 원액을 5밀리리터의 DMEM 또는 F12 배지에 첨가하여 프로테아제 원액을 작업 농도로 희석합니다. 세포 배양 배지를 흡인 및 제거한 다음 hESC를 프로테아제 용액으로 덮습니다. 플레이트를 인큐베이터에 10-15분 동안 또는 콜로니의 가장자리가 반올림되어 매트릭스에서 분리되기 시작할 때까지, 그러나 완전히 반올림되기 전에

놓습니다.

플레이트를 기울이고 프로테아제 용액을 흡인한 다음 각 웰에 대해 2밀리리터의 DMEM 또는 F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 콜로니가 매트릭스에 부착된 상태로 유지되는지 확인하십시오.

따라서 SL 조각이 적절한 크기인 것이 중요합니다. 따라서 적절한 시간 동안 분산되어 있는지 확인하십시오. 너무 짧은 시간 동안 거기에 있으면 씻어내고 분해하기가 매우 어려울 수 있습니다. 그리고 너무 오래 거기에 있으면 실제로 세탁 단계에서 벗겨질 수 있습니다.

각 웰에 약 1 내지 1.5밀리리터의 신선한 mTESR 배지를 다시 추가하고, 부드러운 피펫팅을 사용하여 플레이트의 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 플러싱하고, 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 플레이트 내에서 hESC를 흡인 및 분배합니다. 이제 군집 클러스터는 250-350마이크로미터 크기의 조각과 비슷합니다.

세포를 bFGF가 없는 mTESR 배지 밀리리터가 들어 있는 단일