0 조회수 • 7:57 분 • July 8th, 2025
형질전환 임신한 마우스를 가져와 형광 표지된 운동 뉴런을 포함하는 배아로 자궁을 외과적으로 제거합니다.
형광 현미경으로 얼음처럼 차가운 완충액이 있는 접시에 자궁을 옮깁니다.
가시광선을 사용하여 배아를 분리합니다.
배아의 얼굴과 꼬리를 제거하고 엎드린 자세로 향하게 합니다.
형광 신호를 사용하여 중뇌를 절개하여 운동 뉴런을 포함하는 안구 운동 및 활차핵을 노출시킵니다.
핵을 포함하는 중뇌를 분리합니다.
후뇌와 척수의 등쪽을 엽니다. 척수를 분리하고 양쪽 끝을 절제한 다음 척수 운동 뉴런이 포함된 기둥을 수집합니다.
수집된 조직을 효소로 처리하여 조직 기질을 해리시킵니다. 단일 세포를 수확하고 FACS를 사용하여 형광 표지된 뉴런을 분리합니다.
분리된 뉴런에 배양 배지를 추가하고 세포를 배양 기질로 코팅된 마이크로플레이트로 옮기고 배양하여 세포가 부착되고 성장할 수 있도록 합니다.
배양에서 운동 뉴런을 유지합니다.
수정 후 약 11.5일 후에 임신한 쥐로부터 Islet-1 EGF 양성 배아를 수확하는 것으로 시작합니다. 복부에 에탄올을 철저히 뿌리고 멸균 미세해부 가위와 엄지 드레싱 겸자로 자궁을 제거합니다. 멸균 PBS로 자궁을 잠깐 씻습니다. 그런 다음 사전 냉각된 멸균 PBS로 채워진 해부판으로 옮깁니다.
현미경의 밝은 빛 아래에서 미세 해부 가위, 엄지 드레싱 겸자 및 Dumont Number 5 핀셋을 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 멸균 Moria 미니 천공 스푼을 사용하여 각 배아를 1X V27이 보충된 사전 냉각된 Hibernate E 저형광 배지로 채워진 24웰 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다.
플레이트를 얼음 위에 보관하면서 하나의 배아를 멸균 해부 플레이트로 옮기고 얼음처럼 차가운 멸균 Hank's Balanced Salt Solution 또는 HBSS로 완전히 덮습니다. 핀셋을 사용하여 중뇌를 손상시키지 않고 배아의 얼굴과 꼬리를 제거합니다. 그런 다음 팔다리에 걸터앉고 꼬리가 현미경 앞쪽을 향하도록 배아를 엎드린 상태로 놓습니다.
핀셋을 사용하여 작은 구멍을 생성하기 위해 제4뇌실의 지붕을 자릅니다. 이 구멍을 사용하여 네 번째 뇌실과 지붕 사이에 만들어진 공간에 핀셋을 걸 수 있습니다. 배아 주둥이의 등쪽 표면을 따라 피질까지, 바닥판과 운동기둥의 측면
을 해부합니다.그런 다음 해부된 조직을 오픈 북 방식으로 열어 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 드러냅니다. 배아에서 복부 중뇌를 조심스럽게 분리하고 핀셋과 미세해부 칼로 수막 조직을 제거합니다.
양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 바닥판 및 기타 GFP 양성 주변 조직에서 분리하여 뉴런을 만지거나 손상시키지 않도록 주의합니다. 별도의 CN3 및 CN4 핵을 수집하는 경우 이 두 핵의 중뇌를 따라 절단하고 P1000 피펫을 사용하여 최소한의 HBSS로 해부된 복부 중뇌 조직을 수집합니다.
해부 배지로 채워진 라벨이 붙은 1.7밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 해리될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 총 수가 실험 요구 사항을 충족할 때까지 동일한 튜브의 추가 배아에서 복부 중뇌를 계속 풀링합니다.
복부 척수를 해부하려면 머리가 현미경 앞쪽을 향하도록 배아를 엎드린 상태로 유지하십시오. 핀셋 한 쌍으로 잡고 다른 쌍의 끝을 제4뇌실의 열리지 않은 꼬리 부분에 삽입합니다. 배아의 전체 주꼬리 범위에 걸쳐 뒷뇌와 척수의 나머지 부분을 등쪽으로 엽니다. 집게를 가위로 사용하여 제4뇌실에서 시작하여 꼬리 척수의 중심관을 향해 등쪽 조직을 절단합니다.
그런 다음 핀셋 한 세트로 배아를 잡고 다른 쌍으로 양쪽의 등쪽 조직 플랩을 꼬집습니다. 미세해부 칼을 사용하여 GFP 양성 SMN 바로 아래를 뚫고 양쪽을 톱처럼 움직여 복부 척수를 들어 올려 복부 척수를 제거합니다.
하지의 상부 경계에서 척수를 가로로 절단하고 경추 요추 부분을 제거합니다. 첫 번째 GFP 양성 전방 뿔이 돌출된 C1 바로 위를 가로로 절단합니다. 복부 척수 등쪽을 위로 향하게 놓고 핀셋으로 GFP 양성 SMN 컬럼 사이의 GFP 음성 조직을 눌러 잡습니다.
미세해부 나이프로 GFP 양성 SMN 컬럼의 양쪽을 다듬어 나머지 부착된 중간엽, DRG 및 등쪽 척수를 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 최소한의 HBSS로 해부된 복부 척수 조직을 수집하고 해부 배지로 채워진 라벨이 부착된 1.7밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 해리될 때까지 얼음 위에 보관하고 동일한 튜브에 있는 추가 배아의 복부 척수를 계속 모으십시오.
해부된 조직 샘플이 있는 각 미세 원심분리기 튜브에 적절한 양의 파파인 용액을 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 손가락으로 10분마다 튜브를 교반합니다.
배양 후, P200 피펫으로 각 현탁액을 8회 부드럽게 분쇄합니다. 300배g에서 5분 동안 원심분리합니다. 적절한 부피의 알부민 오보무코이드 억제제 용액으로 세포 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 P1000 피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 적절한 부피의 해부 배지에 세포를 재현탁합니다. 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과합니다.
다음으로, FACS 분류를 사용하여 CN3, CN4 및 SMN에서 해부된 GFP 양성 세포를 분리합니다. 섭씨 37도로 예열된 운동 뉴런 배양 배지로 분리된 세포 현탁액을 적절한 밀도로 희석하고 PDL-라미닌 코팅 96웰 플레이트의 웰에 200마이크로리터의 현탁액을 첨가합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 뉴런을 배양하고 5일마다 모터 뉴런 배양 배지를 새로 고쳐야 합니다.