Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo(쥐 배아에서 눈동자, 트로클리어, 척추 운동 뉴런의 분리와 배양)

형질전환 임신한 마우스를 가져와 형광 표지된 운동 뉴런을 포함하는 배아로 자궁을 외과적으로 제거합니다.

형광 현미경으로 얼음처럼 차가운 완충액이 있는 접시에 자궁을 옮깁니다.

가시광선을 사용하여 배아를 분리합니다.

배아의 얼굴과 꼬리를 제거하고 엎드린 자세로 향하게 합니다.

형광 신호를 사용하여 중뇌를 절개하여 운동 뉴런을 포함하는 안구 운동 및 활차핵을 노출시킵니다.

핵을 포함하는 중뇌를 분리합니다.

후뇌와 척수의 등쪽을 엽니다. 척수를 분리하고 양쪽 끝을 절제한 다음 척수 운동 뉴런이 포함된 기둥을 수집합니다.

수집된 조직을 효소로 처리하여 조직 기질을 해리시킵니다. 단일 세포를 수확하고 FACS를 사용하여 형광 표지된 뉴런을 분리합니다.

분리된 뉴런에 배양 배지를 추가하고 세포를 배양 기질로 코팅된 마이크로플레이트로 옮기고 배양하여 세포가 부착되고 성장할 수 있도록 합니다.

배양에서 운동 뉴런을 유지합니다.

수정 후 약 11.5일 후에 임신한 쥐로부터 Islet-1 EGF 양성 배아를 수확하는 것으로 시작합니다. 복부에 에탄올을 철저히 뿌리고 멸균 미세해부 가위와 엄지 드레싱 겸자로 자궁을 제거합니다. 멸균 PBS로 자궁을 잠깐 씻습니다. 그런 다음 사전 냉각된 멸균 PBS로 채워진 해부판으로 옮깁니다.

현미경의 밝은 빛 아래에서 미세 해부 가위, 엄지 드레싱 겸자 및 Dumont Number 5 핀셋을 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 멸균 Moria 미니 천공 스푼을 사용하여 각 배아를 1X V27이 보충된 사전 냉각된 Hibernate E 저형광 배지로 채워진 24웰 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다.

플레이트를 얼음 위에 보관하면서 하나의 배아를 멸균 해부 플레이트로 옮기고 얼음처럼 차가운 멸균 Hank's Balanced Salt Solution 또는 HBSS로 완전히 덮습니다. 핀셋을 사용하여 중뇌를 손상시키지 않고 배아의 얼굴과 꼬리를 제거합니다. 그런 다음 팔다리에 걸터앉고 꼬리가 현미경 앞쪽을 향하도록 배아를 엎드린 상태로 놓습니다.

핀셋을 사용하여 작은 구멍을 생성하기 위해 제4뇌실의 지붕을 자릅니다. 이 구멍을 사용하여 네 번째 뇌실과 지붕 사이에 만들어진 공간에 핀셋을 걸 수 있습니다. 배아 주둥이의 등쪽 표면을 따라 피질까지, 바닥판과 운동기둥의 측면

을 해부합니다.

그런 다음 해부된 조직을 오픈 북 방식으로 열어 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 드러냅니다.