Magnetic-Activated Cell Sorting을 이용한 CD31+ 내피 전구 세포의 정제

0 views • 5:32 min • July 8th, 2025

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뇌 미세혈관 내피 세포의 전구체인 내피 전구 세포 또는 EPC의 부착 배양을 취하십시오.

만능줄기세포를 분화시켜 얻은 배양물은 표면 마커 CD31에 대해 양성인 EPC와 오염된 CD31 음성 세포를 포함한다.

해리 시약과 함께 배양하여 세포를 분리하고 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

효소를 중화하기 위해 배지를 추가하고, 원심분리하여 상층액을 버리고, 세포를 완충액에 재현탁합니다.

세포 Fc 수용체를 억제하여 비특이적 표지를 방지하기 위해 차단 시약과 함께 배양합니다.

CD31에 특이적인 형광단 접합 항체를 추가하고 배양하여 EPC를 표지합니다.

결합되지 않은 항체를 원심분리하고 폐기합니다. 형광단에 결합하는 하나의 항체를 포함하는 항체 복합체와 함께 배양합니다.

폴리머 코팅된 자성 나노입자를 도입하고 배양하여 나노입자가 복합체의 두 번째 항체에 결합할 수 있도록 합니다.

자기장을 사용하여 나노입자 결합 세포를 분리합니다.

표지되지 않은 CD31 음성 세포가 있는 현탁액을 버리고 정제된 세포를 배지에 재현탁합니다. CD31 양성 EPC는 다운스트림 분석에 사용할 준비가 되어 있습니다.

내피 전구 세포 배양 5일째에 웰에서 배지를 흡인하고 각 웰에 1밀리리터의 해리 시약을 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 6-8분 동안 배양합니다. 마이크로피펫을 사용하여 세포를 해리 및 단일화한 다음 세포 현탁액을 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시켜 10밀리리터의 DMEM/F-12 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 여과합니다.

소화 반응을 멈추려면 DMEM/F-12/10 10 배지를 50밀리리터 표시까지 첨가하십시오. 세포 계수를 위해 완전히 피펫팅하고 10마이크로리터를 예약합니다. 50밀리리터 튜브를 섭씨 20도에서 25도에서 5분 동안 200g으로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 10밀리리터의 DMEM/F-12/10 배지로 재현탁합니다.

세포 현탁액을 새로운 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 200g에서 섭씨 20-25도에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 다시 펠릿화합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 유동 완충액 1에 재현탁합니다. 다음으로, FcR 차단 시약을 1:100 비율로 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 1 대 200 비율의 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 표지 CD31 항체를 첨가합니다.

탁액을 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 10밀리리터의 유동 완충액 1을 샘플에 첨가하고 CD31 양성 세포의 분획을 결정하기 위해 유세포 분석을 위해 현탁액 10마이크로리터를 예약합니다. 세포를 섭씨 20도에서 25도에서 5분 동안 200g으로 원심분리합니다. 원심분리 후, 유동 완충액 1 용액으로 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 세포 현탁액 100마이크로리터당 5마이크로리터의 FITC 선택 칵테일을 추가합니다. 피펫팅으로 용액을 완전히 혼합하고 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 15분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 다음으로, 세포 현탁액 100마이크로리터당 5마이크로리터의 자성 나노입자를 첨가합니다. 혼합물을 잘 피펫팅하고 섭씨 20-25도에서 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.

세포 현탁액을 5밀리리터 유세포 분석 튜브로 옮기고 유동 완충액 1을 첨가하여 총 부피 2.5밀리리터를 얻습니다. 그런 다음 유세포 분석 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다. 연속적인 동작으로 자석을 뒤집고 FITC-CD31 항체 표지 되지 않은 세포가 포함된 세포 현탁액을 디캔팅합니다. 자석과 튜브를 2-3초 동안 거꾸로 된 위치에 유지한 다음 남은 액체를 제거합니다.

튜브를 수직 위치로 되돌리기 전에 튜브 가장자리의 물방울을 흡입하십시오. 자석에서 유세포 분석 튜브를 꺼내고 2.5밀리리터의 유동 완충액 1을 첨가하여 나머지 CD31 양성 세포를 세척합니다. 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 그런 다음 유동관을 자석에 5분 동안 넣습니다.

튜브에서 FITC-CD31 표지되지 않은 세포를 제거하기 위해 세척을 최소 4회 반복합니다. 자석에서 유동관을 제거하고 정제된 CD31 양성 세포를 원하는 양의 적절한 배지로 재현탁합니다. 현탁액의 1마이크로리터 분취량 2개를 예약하고, 하나는 세포 계수용이고, 두 번째는 유세포 분석을 수행하여 자기 활성화 후 세포 분류 샘플에서 CD31 양성 세포의 순도를 평가합니다.

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