인간 신경 줄기 세포를 신경 및 성상 세포 전구 세포로 분화

세포 배양 유래 컨디셔닝 배지에 있는 인간 신경 줄기 세포의 3차원 응집체인 비부착 신경구로 시작합니다.

이 배지에는 세포 생존력을 유지하는 영양소, 성장 인자 및 세포외 기질 성분이 포함되어 있습니다.

신경구를 수집하기 위해 원심분리기.

트립신과 DNase 효소로 처리하고 내용물을 혼합한 다음 배양합니다.

트립신은 세포 간 접착을 방해하고 세포 박리를 촉진하는 반면, DNase는 유리 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지합니다.

내용물을 반복적으로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 형성합니다. 그런 다음 트립신 억제제를 첨가하여 효소 활성을 중화시킵니다.

원심분리하여 상청액을 제거한 다음 신경 성장 인자를 포함하는 증식 배지에 세포를 재현탁합니다.

멀티웰 플레이트에 놓인 폴리머 코팅된 커버슬립에 세포 현탁액을 시드합니다. 줄기 세포가 폴리머에 부착될 수 있도록 배양합니다.

또한, 특정 성장 인자의 흡수를 기반으로 줄기 세포는 신경 및 성상세포 전구세포로 분화하여 특수 세포 유형으로 추가 성숙할 준비가 됩니다.

텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지를 준비하고 인간 신경 줄기 세포를 도금한 후, 인큐베이터에서 계대할 세포 플라스크를 꺼내 생물 안전 캐비닛 또는 BSC로 가져옵니다. 플라스크를 부드럽게 기울여 세포가 풀링된 배지의 바닥으로 가라앉도록 합니다.

10밀리리터의 배지를 2개의 5밀리리터 부분으로 조절된 배지의 경우 "CM"이라고 표시된 깨끗한 15밀리리터 튜브에 옮깁니다. 플라스크에 침전된 세포를 흡인하지 않도록 주의하십시오. CM 튜브에서 "트립신 억제제 용액"이라고 표시된 15밀리리터 튜브로 3밀리리터의 배지를 옮깁니다. 그런 다음 CM 튜브를 따로 보관하십시오.

그런 다음 T75 플라스크에 남아 있는 5밀리리터의 배지와 세포를 제거하고 "세포"라고 표시된 깨끗한 15밀리리터 튜브에 넣습니다. 그런 다음 혈청학적 피펫과 3.5밀리리터 부피의 CM을 사용하여 T75 플라스크를 두 번 헹구고 CM 헹굼을 '세포' 튜브로 옮깁니다. 이렇게 하면 T75 플라스크에서 모든 신경구가 제거됩니다.

'세포' 튜브를 실온에서 100배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포가 회전하는 동안 섭씨 37도 수조에서 미리 준비된 DPBS 포도당 용액을 얻고 적당량의 트립신과 DNase를 첨가합니다.

'세포' 튜브가 회전을 멈춘 후 컨디셔닝된 배지 상청액을 모두 제거하고 CM 튜브로 옮깁니다. 15밀리리터 튜브의 세포 펠릿에 트립신 용액을 첨가하고 5밀리리터 피펫을 사용하여 약 5-10회 위아래로 피펫팅합니다. 튜브의 캡을 닫고 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양합니다.

트립신 억제제 튜브에 적절한 양의 트립신 억제제를 추가하고, 트립신 용액에 사용된 것과 동일한 양의 용액을 첨가합니다. 그런 다음 필요할 때까지 트립신 억제제 용액을 섭씨 37도 수조에 넣습니다.

배양 후, 세포를 위아래로 5-10회 피펫팅합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 추가로 10-15분 동안 배양합니다. 세포 배양 후, 구체가 완전히 해리될 때까지 세포를 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 즉시 트립신 억제제 용액을 첨가하고 세포 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅합니다.

현탁액의 세포 수를 계산하려면 15마이크로리터의 트리판 블루 프리믹스를 작은 계량 보트에 피펫팅하고 5마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 위아래로 3-5회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 트리판 블루 셀 현탁액을 유리 커버슬립으로 덮은 혈구계의 양쪽에 옮깁니다.

광학 현미경으로 세포를 관찰하고 네 모서리 격자 각각의 총 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 이 숫자를 더합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포 수를 계산한 후, 각 T75 플라스크에 세포 현탁액의 부피를 추가하여 플라스크당 5 x 10⁶ 세포를 얻습니다.

부피가 5밀리리터 미만인 경우 최대 5밀리리터까지 컨디셔닝 배지를 추가합니다. 그런 다음 성장 인자를 함유한 새로운 DFHGFPS 배지 10밀리리터를 플라스크에 추가합니다. 플라스크에 세포 유형, 날짜, 플라스크의 세포 수 및 계대 번호가 표시되어 있는지 확인하십시오. 원하는 경우 이 시점에서 세포를 배양합니다.

부착된 HNSC를 플레이트하려면 계대 전날 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 BSC를 세척하고 집게를 사용하여 단일 멸균 12mm 유리 커버슬립을 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 멸균수에 0.01% Poly-D-Lysine 또는 PDL의 웰당 250마이크로리터로 커버슬립으로 웰을 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 웰에서 PDL을 제거한 다음 평방 센티미터당 1마이크로그램의 라미닌 DPBS로 코팅합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 필요하지 않은 경우 플레이트 가장자리에 파라필름을 감아 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관합니다. 흡인을 통해 우물에서 과도한 라미닌 용액을 제거하고 0.5밀리리터의 DPBS를 사용하여 우물을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 평방 센티미터당 0.6 내지 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 각 웰에 세포를 시드합니다.