인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

Rho-kinase 억제제가 보충된 줄기 세포 배지에 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC를 포함하는 저부착 웰 플레이트로 시작합니다.

억제제는 세포에 들어가 Rho-kinase 효소를 차단하고 세포 생존력을 유지합니다. 이것은 iPSC 응집체의 형성을 촉진합니다.

배지를 줄기세포 배지로 교체하여 응집체가 성장할 수 있도록 합니다. 피질 유도 배지가 있는 저부착 배양 접시로 옮깁니다.

이 배지의 성분은 iPSC가 신경 전구체인 신경외배엽 세포로 분화하도록 합니다.

각 신경외배엽 응집체를 얕은 우물이 있는 필름에 옮깁니다.

배지를 기저막 매트릭스로 교체하고 배양하여 매트릭스 응고 및 응집체의 포획을 허용합니다.

이러한 매트릭스 포매 응집체를 피질 유도 배지가 들어 있는 접시로 옮기고 교반하면서 배양합니다.

시간이 지남에 따라 신경외배엽 세포는 분화 인자를 활용하여 신경상피 세포로 발달합니다.

배지를 오가노이드 분화 배지로 변경하면 세포가 보다 특수한 세포 유형으로 성숙하여 전뇌 피질과 유사한 대뇌 오가노이드를 형성할 수 있습니다.

만능 줄기 세포 응집체를 생성하려면 줄기 세포 배양이 70% 내지 90% 컨플루언도에 도달하면 6웰 배양 플레이트 중 하나의 웰에 500마이크로리터의 세포 해리 시약을 첨가하여 세포를 분리합니다.

단층 배양 조건에 적응된 유도만능줄기세포는 해리 및 응집 과정에서 스트레스로 인한 세포 사멸이 덜하기 때문에 응집체를 생성하기에 좋은 세포 유형입니다.

섭씨 37도에서 5-10분 후, 플레이트를 부드럽게 두드리고 DMEM/F-12 2밀리리터를 사용하여 웰 바닥에서 세포를 세척합니다. 생성된 세포 현탁액을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 더 많은 DMEM/F-12 배지로 세포 용액의 부피를 최대 10밀리리터까지 가져옵니다.

계수 후, 만능줄기세포 응집체당 3번째 세포에 10배의 4.5배를 새로운 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 50마이크로몰 ROCK 억제제를 보충한 적절한 부피의 만능 줄기 세포 배지에 펠릿을 재현탁하여 배지 농도 150마이크로리터당 4.5 x 10³ 세포를 달성합니다.

다음으로, 150마이크로리터의 세포를 96웰 저부착 U-바닥 플레이트의 개별 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 전방 신경외배엽 유도를 모니터링하기 위해 조직 배양 현미경을 사용하여 저배율에서 매일 만능 줄기 세포 응집체의 형태학적 변