인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

Rho-kinase 억제제가 보충된 줄기 세포 배지에 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC를 포함하는 저부착 웰 플레이트로 시작합니다.

억제제는 세포에 들어가 Rho-kinase 효소를 차단하고 세포 생존력을 유지합니다. 이것은 iPSC 응집체의 형성을 촉진합니다.

배지를 줄기세포 배지로 교체하여 응집체가 성장할 수 있도록 합니다. 피질 유도 배지가 있는 저부착 배양 접시로 옮깁니다.

이 배지의 성분은 iPSC가 신경 전구체인 신경외배엽 세포로 분화하도록 합니다.

각 신경외배엽 응집체를 얕은 우물이 있는 필름에 옮깁니다.

배지를 기저막 매트릭스로 교체하고 배양하여 매트릭스 응고 및 응집체의 포획을 허용합니다.

이러한 매트릭스 포매 응집체를 피질 유도 배지가 들어 있는 접시로 옮기고 교반하면서 배양합니다.

시간이 지남에 따라 신경외배엽 세포는 분화 인자를 활용하여 신경상피 세포로 발달합니다.

배지를 오가노이드 분화 배지로 변경하면 세포가 보다 특수한 세포 유형으로 성숙하여 전뇌 피질과 유사한 대뇌 오가노이드를 형성할 수 있습니다.

만능 줄기 세포 응집체를 생성하려면 줄기 세포 배양이 70% 내지 90% 컨플루언도에 도달하면 6웰 배양 플레이트 중 하나의 웰에 500마이크로리터의 세포 해리 시약을 첨가하여 세포를 분리합니다.

단층 배양 조건에 적응된 유도만능줄기세포는 해리 및 응집 과정에서 스트레스로 인한 세포 사멸이 덜하기 때문에 응집체를 생성하기에 좋은 세포 유형입니다.

섭씨 37도에서 5-10분 후, 플레이트를 부드럽게 두드리고 DMEM/F-12 2밀리리터를 사용하여 웰 바닥에서 세포를 세척합니다. 생성된 세포 현탁액을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 더 많은 DMEM/F-12 배지로 세포 용액의 부피를 최대 10밀리리터까지 가져옵니다.

계수 후, 만능줄기세포 응집체당 3번째 세포에 10배의 4.5배를 새로운 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 50마이크로몰 ROCK 억제제를 보충한 적절한 부피의 만능 줄기 세포 배지에 펠릿을 재현탁하여 배지 농도 150마이크로리터당 4.5 x 10³ 세포를 달성합니다.

다음으로, 150마이크로리터의 세포를 96웰 저부착 U-바닥 플레이트의 개별 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 전방 신경외배엽 유도를 모니터링하기 위해 조직 배양 현미경을 사용하여 저배율에서 매일 만능 줄기 세포 응집체의 형태학적 변화를 면밀히 관찰합니다.

1일째에는 경계가 명확한 세포 응집체를 관찰해야 합니다. 2일째에 각 웰의 바닥에 있는 세포 응집체를 방해하지 않고 배지의 약 2/3를 조심스럽게 흡인하고 폐기된 배지를 100마이크로리터의 신선한 만능 줄기 세포 배지로 교체합니다.

4일에서 6일 사이에 세포 응집체가 직경이 350 내지 450마이크로미터에 도달하고 가장자리가 매끄러워지면 수정된 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 최대 20개의 응집체를 5밀리리터의 피질 유도 배지가 포함된 단일 6센티미터 저부착 배양 플레이트로 옮깁니다.

피질 유도 배지를 3일에 한 번씩 신선한 배지로 교체하고 4x 목표 하에서 매일 응집체의 형태를 모니터링합니다. 피질 유도 배지에서 4-5일 후, 세포 응집체의 가장자리가 표면에서 밝아지기 시작하여 신경 외배엽 분화를 나타내고 가성층화 상피의 방사형 조직이 나타나야 합니다.

신경외배엽 응집체를 매트릭스 스캐폴드에 매립하려면 기저막 추출물을 얼음 위에 2-3시간 동안 채웁니다. 추출물이 해동되는 동안 멸균 가위를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름을 오가노이드 16개당 4x4센티미터 정사각형 1개로 자르고 각 필름 조각을 빈 100마이크로리터 마이크로피펫 팁 트레이 위에 놓습니다.

장갑을 낀 손가락 끝으로 파라핀 필름을 눌러 작은 보조개가 나타나도록 하고 70% 에탄올로 필름을 청소합니다. 밀폐된 멸균 생물안전 캐비닛에서 30분 동안 UV 조사한 후, 1 및 1/2에서 2mm의 개구부가 있는 수정된 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 세포 응집체를 필름의 하나의 딤플로 옮깁니다.

모든 응집체가 옮겨지면 절단되지 않은 100마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 딤플에서 배지를 조심스럽게 흡인하고 각 세포 응집체에 40마이크로리터의 희석되지 않은 기저막 추출물을 추가합니다.

칠게 조작하거나 피펫 팁으로 흡인하여 오가노이드를 손상시키면 발달 중인 신경상피가 손상되지 않도록 주의하십시오.

피펫 팁을 사용하여 응집체를 각 방울의 중앙에 배치하고 멸균 겸자를 사용하여 플라스틱 파라핀 필름 시트를 10cm 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 접시를 인큐베이터에 15-20분 동안 넣습니다.

추출물이 응고되는 동안 5밀리리터의 신선한 피질 유도 배지를 6cm 낮은 부착 배양 접시 1개에 추가합니다. 배양이 끝나면 파라핀 필름 시트를 뒤집고 멸균 집게를 사용하여 최대 16개의 중합 물방울을 각 6cm 접시에 부드럽게 짜냅니다. 그런 다음 응집체를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

다음날, 응집체가 관심 있는 분화 단계에 도달할 때까지 매일 광학 현미경 모니터링을 통해 세포 배양 인큐베이터 내에서 14RPM에서 5도 각도로 기울어진 흔들리는 세포 배양 셰이커에 오가노이드 배양 접시를 옮깁니다.