쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

0 조회수3:52 • July 8th, 2025

신경능선 세포(NCC)의 후손인 형광 단백질 발현 지방 유래 줄기 세포를 포함하는 수확된 형질전환 마우스 대동맥 주위 지방 조직을 취하십시오.

소화 배지를 넣고 조직을 다지십시오.

소화 배지와 함께 다진 조직을 튜브로 옮깁니다. 조각을 기계적으로 분리합니다.

인큐베이트. 배지의 콜라게나제는 조직의 세포외 기질을 소화하여 줄기 세포, 지방세포 및 섬유아세포를 방출합니다.

혈청 함유 배지를 첨가하여 콜라게나제 활성을 멈춥니다. 지방세포를 함유한 상청액을 원심분리하여 버립니다.

세포를 배지에 재현탁하고 여과하여 응집체를 제거합니다.

여과액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 적혈구를 용해하기 위해 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.

용해를 멈추기 위해 혈청 함유 완충액을 첨가하십시오. 원심분리하여 상청액을 버립니다.

세포를 완충액에 재현탁합니다.

형광 활성화 세포 분류를 수행하여 형광 줄기 세포를 분리합니다.

분리

된 줄기 세포는 추가 실험에 사용될 수 있습니다.

수확한 지방 조직을 새로 준비된 소화 배지 1밀리리터가 들어 있는 새로운 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 수술용 가위를 사용하여 조직을 다집니다. 조직 슬러리를 9밀리리터의 신선한 소화 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 옮기고 1밀리리터 피펫을 사용하여 조직을 10회 분쇄합니다.

균질한 용액을 얻으면 튜브를 섭씨 37도 및 분당 100회전에서 30-45분 동안 배양하고 과소화를 방지하기 위해 5-10분마다 확인합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치면서 연한 노란색의 균질한 지방 조직 용액이 관찰될 수 있는 경우, 10% 소태아 혈청을 보충한 5밀리리터의 HDMEM으로 소화를 중단합니다. 완전히 혼합한 후 지방 조직 샘플을 원심분리합니다.

간질 혈관 세포 분획은 갈색을 띤 알갱이로 보입니다. 펠릿을 10밀리리터의 배양 배지에 재현탁하고 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.

또 다른 원심분리를 통해 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 부드럽게 재현탁합니다. 서스펜션을 15mm 튜브로 옮깁니다. 10분 후, 1% 소 태아 혈청을 보충한 PBS 10밀리리터에 2회 원심분리하여 반응을 중지합니다.

두 번째 원심분리 후, 펠릿을 얼음 위의 배양 배지 5밀리리터에 재현탁하고 최종 원심분리로 세포를 수집합니다. 그런 다음 계수를 위해 세포를 5밀리리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다.

표준 프로토콜에 따라 FACS에 의해 분리된 후 NCADSC 배양을 설정하려면 세포를 각 웰에cm2당 5 x 103 세포 농도로, 12웰 배양 플레이트를 완전 배양 배지에 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소를 20 내지 24시간 동안 배치합니다. 다음날, 세포를 섭씨 37도 PBS로 세척하고 배양액에 신선한 배양 배지를 공급합니다.

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마지막 업데이트: 29 8월 2026