쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

이전에 세로 근육과 근신경총, 장 뉴런을 포함하는 층 및 신경교 세포에서 이전에 제거된 마우스 소장 분절을 취하십시오.

조직을 잘라 EDTA가 들어 있는 완충액에 넣습니다. 흔들면서 인큐베이팅하십시오.

EDTA는 세포-세포 접합부를 파괴하여 장 신경교세포를 포함하는 결합 조직층인 기본 고유층 및 점막하층에서 상피 점막을 분리합니다.

피펫팅을 반복하여 상피 세포를 제거합니다.

셀 스트레이너를 통해 여과하고 유동을 버립니다.

조직을 비효소 해리 완충액으로 옮기고 흔들면서 배양합니다. 해리 완충액은 고유층과 점막하 세포외 기질을 느슨하게 하여 세포를 분리합니다.

세포를 더 해리시키기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.

세포 여과기를 통해 여과하여 세포를 수집합니다.

세포를 원심분리하고 완충액에 재현탁합니다.

신경교 성장 배지가 포함된 접착 단백질 코팅 웰을 가져와 세포를 플레이트합니다.

코팅은 세포 접착을 촉진하는 반면, 성장 인자는 신경교 세포 증식을 선택적으로 촉진하여 고유층과 점막하 신경교 세포 배양을 확립합니다.

상피 점막을 제거하려면 먼저 가는 가위를 사용하여 장을 약 0.5cm 크기로 자르고 얼음처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 용액 30ml에 모아줍니다. 조직 함유 용액을 섭씨 4도에서 분당 약 60회 기울기로 10분 동안 흔듭니다.

EDTA/HEPES/DPBS 완충액을 위아래로 한 번 피펫팅하여 5밀리리터 플라스틱 피펫을 미리 적신 다음 미리 적신 피펫을 사용하여 조직을 분쇄하고 현탁액을 20회 분쇄하여 상피 점막을 제거합니다.

100미크론 나일론 세포 스트레이너를 통해 혼합물을 부어 조직을 수집하고 바늘 겸자를 사용하여 스트레이너에 남아 있는 조직을 30밀리리터의 얼음처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS가 들어 있는 새로운 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 분당 약 60회 기울기로 섭씨 4도에서 10분 동안 조직을 흔들어 EDTA/HEPES/DPBS 배양을 두 번째로 반복하여 추가 상피 점막을 제거합니다.

미리 적신 5밀리리터 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄합니다. 조직은 더 많은 상피가 제거됨에 따라 피펫 내부에 달라붙는 경향이 있습니다.

이 시점에서 장 신경교세포가 더 약하기 때문에 부드러운 분쇄가 필요합니다.

두 번째 배양 후 혼합물을 100미크론 나일론 셀 스트레이너에 부어 조직을 수집하고 통과하는 흐름을 버립니다. 두 번째 흐름은 첫 번째 흐름보다 눈에 띄게 덜 탁해야 합니다. 용액이 거의 투명해질 때까지 10분 EDTA 배양을 반복합니다.

나일론 스트레이너에서 시중에서 판매되는 세포 회수 용액 5밀리리터가 들어 있는 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 조직을 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 25도에서 30-4분 동안 흔듭니다. 부드럽게 10회 분쇄하여 장내 신경교세포를 고유층에서 해리시킨 다음 40미크론 필터를 통해 여과하고 여과액을 깨끗한 50밀리리터 튜브에 모아줍니다.

일론 필터의 조직을 DPBS 1밀리리터로 헹굽니다. 조직을 버리고 5-6밀리리터의 여과액을 깨끗한 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 여과액을 스윙 버킷 원심분리기에서 섭씨 4도에서 5분 동안 2,000g으로 회전시킵니다.

기포를 일으키지 않고 500마이크로리터 피펫 팁으로 펠릿을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 신경교세포 함유 펠릿을 최소 1밀리리터의 재현탁 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로, 라미닌 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가하거나 신경교 성장 배지를 포함하는 12웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 추가하여 장내 신경교세포를 플레이트합니다.