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신경과학
0 조회수 • 3:28 분 • July 8th, 2025
뇌의 가장 바깥층인 쥐 피질 뇌 조직이 들어 있는 차가운 유리 절구로 시작합니다.
프로테아제 억제제를 함유한 뇌 미세혈관 완충액 또는 BMB를 추가합니다.
이제 유봉을 위아래로 움직여 조직을 해리시킵니다.
이 교반은 미세혈관, 주위 세포, 뉴런 및 신경교 세포로 구성된 신경혈관 단위(NVU)를 방출합니다. 프로테아제 억제제는 방출된 프로테아제를 차단하여 미세혈관을 보호합니다.
이 혼합물을 튜브로 옮깁니다.
조밀한 다당류 용액을 추가합니다. 소용돌이를 사용하여 용액을 다른 내용물과 균일하게 혼합합니다.
원심 분리기. 조밀한 다당류는 조직 파편보다 밀도가 높은 NVU의 침전을 허용합니다.
상청액을 버리고 프로테아제 억제제와 다당류 용액을 함유한 BMB에 NVU를 재현탁합니다.
소용돌이를 사용하여 내용물을 혼합합니다.
원심분리 과정을 반복합니다. 잔여 파편을 제거하기 위해 상층액을 버립니다.
BMB에 NVU를 재일시 중단하고 추가 분석을 위해 저장합니다.
피질 뇌 조직을 차갑게 식힌 유리 절구에 넣습니다. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 BMB 5밀리리터를 추가합니다. 오버헤드 파워 균질화기를 사용하여 절구에 유봉을 삽입하고 3,700RPM에서 15번의 상하 스트로크를 사용하여 뇌 조직을 균질화합니다. 그런 다음 균질을 라벨이 붙은 원심분리기 튜브에 붓습니다. 샘플 사이에 70% 에탄올을 사용하여 유봉을 청소합니다.
원심분리를 수행하려면 뇌 균질염이 포함된 각 표지된 원심분리기 튜브에 8.0밀리리터의 26% 덱스트란 용액을 첨가합니다. 튜브를 두 번 뒤집은 다음 샘플을 완전히 소용돌이치십시오. 뇌 균질염 용액과 26% 덱스트란 용액의 철저한 혼합을 보장하기 위해 여러 각도를 사용하여 각 샘플의 소용돌이를 수행합니다. 샘플을 5,000g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다.
상청액을 흡인하고 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 5.0밀리리터의 BMB에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 펠릿을 소용돌이치게 하여 완전히 혼합되도록 합니다. 다음으로, 방금 시연한 대로 각 원심분리기 튜브에 8.0밀리리터의 26% 덱스트란을 넣고 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 샘플을 다시 원심분리합니다.
진공 플라스크와 유리 피펫을 사용하여 상청액을 흡인하고 뇌 미세혈관이 포함된 펠릿이 파괴되지 않도록 합니다. 펠릿을 프로테아제 억제제로 BMB에 재현탁한 다음 26% 덱스트란을 두 번 더 사용합니다. 최종 원심분리 후 각 펠릿에 5.0밀리리터의 BMB를 추가하고 소용돌이치게 하여 샘플을 재현탁합니다.