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쥐의 척추 부분을 가져와 나누어 척수를 제거합니다.
위성 신경교세포(SGC)로 둘러싸인 뉴런 클러스터인 후근 신경절(DRG)을 분리합니다.
DRG를 성장 배지에 놓습니다. SGC 오염을 줄이기 위해 신경근을 제거합니다.
콜라게나제로 처리하여 조직 기질을 분해하고 세척하여 효소를 제거합니다.
트립신을 도입하여 세포간 연결을 방해합니다. 트립신을 비활성화하는 단백질이 함유된 혈청을 추가합니다.
성장 배지를 첨가하고 조직을 기계적으로 해리시킵니다. 현탁액을 여과하여 단일 세포를 분리하고 원심분리하여 조직 파편을 제거합니다.
세포를 재현탁하여 밀도 구배 배지에 층층화하고 원심분리합니다.
밀도가 높은 뉴런은 바닥에 정착하여 SGC의 분리를 용이
하게 합니다.뉴런을 배양 배지에 재현탁합니다. 이를 배양 기질로 코팅된 웰에 옮겨 세포 부착을 허용합니다.
신경 생존을 위해 신경 성장 인자를 보충합니다.
척수를 채취한 후 DRG 뉴런을 얻으려면 먼저 등쪽 부분을 제거한 다음 멸균되고 날카로운 수술용 가위를 사용하여 척추를 세로 축을 따라 반으로 나누어 척수 조직을 노출시킵니다. 척추를 흉곽 높이 아래의 두 개의 작은 부분으로 자른 다음 가는 겸자를 사용하여 모든 탯줄 조직을 부드럽게 제거하고 근관에서 직접 나오는 흰색 필라멘트로 나타나는 DRG 뿌리를 당기거나 제거하지 않도록 주의합니다.
코어 조직을 모두 제거한 후에는 매우 미세한 겸자를 사용하여 DRG 뿌리 전체를 당겨 척추관 깊숙이 도달하고 신경절 뿌리가 손상되지 않도록 주의합니다. DRG를 항생제가 보충된 3-4밀리리터의 Ham's F-12 배지가 들어 있는 60제곱밀리미터의 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 해부 현미경으로 멸균 겸자와 메스를 사용하여 신경절을 둘러싼 과도한 신경근을 제거하여 위성 세포의 오염을 줄입니다.
다음으로, DRG를 1.8밀리리터의 신선한 F-12 배지가 들어 있는 35제곱밀리미터 페트리 접시에 옮기고 200마이크로리터의 콜라게나제 4형 원액을 첨가합니다. DRG를 1시간 동안 배양한 다음 DRG가 흡인되거나 손상되지 않도록 주의하면서 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
콜라게나제 단계를 반복하고 DRG를 F-12 배지로 세척합니다. 두 번째 세척 후, 1.8밀리리터의 F12 배지와 200마이크로리터의 트립신을 세포에 첨가하고, 트립신을 제거하고 500마이크로리터의 FBS가 보충된 1밀리리터의 배지를 첨가하여 효소 반응을 멈춥니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 DRG를 F-12 배지로 부드럽게 세 번 세척하여 혈청의 모든 흔적을 제거합니다.
이제 세포에 신선한 F-12 배지 2밀리리터를 공급하고 유리 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 위아래로 8-10회 피펫팅하여 뉴런을 부드럽게 해리시킨 다음 펠릿이 튜브 바닥에 축적되도록 합니다. 펠릿이 침전되면 상청액을 새 튜브로 옮기고 펠릿에 신선한 F12 배지 2밀리리터를 첨가하고 현탁액이 균질해질 때까지 기계적 해리와 배지 전달을 반복합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 3-4회 분쇄한 다음 생성된 균질화된 현탁액을 100미크론 세포 여과기를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 15밀리리터 튜브에서 세포를 원심분리합니다. 회전하는 동안 새로 준비된 15% 소 혈청 알부민을 45도 각도로 고정된 15밀리리터 튜브 내부에 천천히 피펫팅하여 튜브의 숫자를 형성 트랙의 기준으로 사용하여 점진적인 단백질 흔적을 만듭니다.
그런 다음 세포에서 상청액을 흡인하여 펠릿을 재현탁하기 위해 마지막 500마이크로리터를 절약하고 단백질 트레일을 따라 세포를 새 튜브에 천천히 분배합니다. 세포를 다시 회전시킨 후, 펠릿을 1밀리리터의 변형된 BS 배지에 재현탁하고 24웰 플레이트에 소량의 배지에 세포를 2시간 동안 시딩합니다. 세포가 부착되면 신경 성장 인자 밀리리터당 50나노그램이 보충된 신선한 BS 배지를 추가합니다.
