성체 쥐의 척수 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 전구 세포의 격리

신경줄기/전구 세포가 풍부한 영역인 성체 쥐의 척수 뇌실주위 조직부터 시작합니다.

조직을 파파인과 DNase가 포함된 용액으로 옮깁니다.

단백질 분해 효소인 파파인은 조직의 세포외 기질을 절단하는 반면, DNase는 손상된 세포에서 방출되는 오염된 DNA를 분해합니다.

조직을 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

현탁액을 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다. 알부민 단백질과 프로테아제 억제제를 함유한 용액에 세포를 재현탁합니다.

알부민과 억제제는 파파인을 비활성화합니다.

알부민과 프로테아제 억제제를 함유한 용액 위에 세포 현탁액을 층층으로 겹겹이 쌓습니다.

층 간의 밀도 차이는 불연속적인 밀도 구배를 형성합니다.

원

심분리하여 온전한 세포를 침전시키고 세포막 단편은 계면에 남아 있습니다.

상청액을 버리십시오. 세포를 성장 배지에 재현탁하고 플레이트합니다.

성장 인자는 신경 줄기/전구 세포의 증식과 3차원 신경구로의 응집을 선택적으로 촉진합니다.

쥐 신경 줄기 세포의 분리를 시작하려면 마이크로 가위를 사용하여 해부된 뇌실주위 조직을 1입방밀리미터 조각으로 자릅니다. 다음으로, 먼저 파파인 해리 키트의 파파인 바이알에 얼의 균형 소금 용액 5밀리리터를 첨가하여 효소 해리 완충액을 준비합니다.

바이알을 섭씨 37도에서 10분 동안 두면 파파인이 완전히 녹고 용액이 투명하게 나타납니다. 그런 다음 해리 키트의 DNase 바이알에 500마이크로리터의 Earl's 균형 소금 용액을 넣고 부드럽게 혼합합니다.

파파인이 들어 있는 바이알에 DNase 용액 250마이크로리터를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 다진 티슈(약 0.2g)를 바이알에 넣고 바이알을 섭씨 37도의 로커 플랫폼에 45분에서 1시간 동안 놓습니다.

배양 후, 10밀리리터 피펫으로 혼합물을 분쇄하여 남은 조직 조각을 해리시켜 탁한 세포 현탁액을 생성합니다. 세포 현탁액을 멸균 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300g에서 원심분리 합니다.

원심분리하는 동안 15밀리리터 원뿔형 튜브에 2.7밀리리터의 얼 균형 염 용액과 300마이크로리터의 재구성된 알부민 오보뮤코이드 억제제 용액을 혼합하여 오보뮤코이드 용액을 준비합니다. 이전에 준비한 DNase 용액 150마이크로리터를 오보뮤코이드 용액에 넣고 튜브를 반전시켜 혼합합니다.

펠릿화된 세포에서 상청액을 버리고 희석된 DNase 알부민-억제제 혼합물에 세포 펠릿을