Isolating and Culturing Mouse Cerebral Pericytes(쥐 대뇌 주위 세포의 분리 및 배양)

마우스 뇌 조직에 완충액을 첨가하고 균질화하여 세포와 미세혈관을 방출합니다.

다음으로, BSA-덱스트란 용액을 균질체에 첨가합니다. 혼합하고 원심분리하여 성분을 분리합니다. 상청액을 버리십시오.

미세혈관을 완충액에 재현탁하고 필터를 통과시켜 더 큰 혈관을 제거합니다.

이제 여과액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. DNAs를 함유한 완충액에 미세혈관을 재현탁합니다.

단백질 분해 효소를 첨가하여 내피 세포와 주위 세포를 방출합니다.

DNas는 DNA를 분해합니다.

효소 활성을 멈추기 위해 BSA를 함유한 완충액을 첨가하십시오. 원심분리하여 상청액을 버립니다.

세포를 배지에 재현탁하고 기저 매트릭스 코팅 멀티웰 플레이트에 도금합니다. 배양하여 세포 접착을 촉진합니다.

미디어를 정기적으로 교체하십시오.

내피 세포는 단층을 형성하고 주위 세포 성장을 지원합니다.

젤라틴으로 코팅된 멀티웰 플레이트의 주위 세포 배지에서 후속 세포 계대는 내피 세포를 제거하면서 주위 세포 성장을 촉진합니다.

특정

병원균이 없는 4주에서 6주 된 수컷 C57 흑색 6 마우스의 뇌를 멸균되고 건조하며 보푸라기가 없는 물티슈 위에 놓고 구부러진 팁 겸자를 사용하여 소뇌, 선조체 및 후두 신경을 제거합니다. 면봉을 사용하여 눈에 보이는 수막을 모두 제거하고 뇌 조직을 거꾸로 뒤집습니다. 바깥쪽으로 가볍게 스트로크하여 엽을 열고 눈에 보이는 모든 혈관을 제거합니다. 그런 다음 수막이 없는 뇌 조직을 15밀리리터의 저온 세척 완충액 B가 들어 있는 100밀리미터 페트리 접시에 넣습니다.

조직을 균질화하려면 뇌 샘플을 Dounce Tissue Grinder 모르타르 튜브로 옮기고 3-4밀리리터의 세척 완충액 B를 튜브에 추가합니다. 느슨한 유봉을 사용하여 조직을 55번 다집니다. 그런 다음 유봉을 세척 완충액 B로 헹구고 단단한 유봉으로 조직 슬러리를 25회 다집니다. 균질화가 끝나면 두 개의 50밀리리터 튜브 사이에 슬러리를 균등하게 분취하고 차가운 30% 소 혈청 알부민 덱스트란의 1.5배를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 세게 흔들어 슬러리를 혼합합니다.

혈관 분획을 분리하려면 원심분리로 세포를 침전시키고 상청액을 두 개의 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 얼음 위의 세척 완충액 B에 보관하십시오. 얼음 위에 3밀리리터의 차가운 세척 완충액 B에 펠릿을 재현탁합니다.

수확한 상청액을 원심분리하고 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 상청액을 버리고 펠릿을