Isolating and Culturing Mouse Cerebral Pericytes(쥐 대뇌 주위 세포의 분리 및 배양)

마우스 뇌 조직에 완충액을 첨가하고 균질화하여 세포와 미세혈관을 방출합니다.

다음으로, BSA-덱스트란 용액을 균질체에 첨가합니다. 혼합하고 원심분리하여 성분을 분리합니다. 상청액을 버리십시오.

미세혈관을 완충액에 재현탁하고 필터를 통과시켜 더 큰 혈관을 제거합니다.

이제 여과액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. DNAs를 함유한 완충액에 미세혈관을 재현탁합니다.

단백질 분해 효소를 첨가하여 내피 세포와 주위 세포를 방출합니다.

DNas는 DNA를 분해합니다.

효소 활성을 멈추기 위해 BSA를 함유한 완충액을 첨가하십시오. 원심분리하여 상청액을 버립니다.

세포를 배지에 재현탁하고 기저 매트릭스 코팅 멀티웰 플레이트에 도금합니다. 배양하여 세포 접착을 촉진합니다.

미디어를 정기적으로 교체하십시오.

내피 세포는 단층을 형성하고 주위 세포 성장을 지원합니다.

젤라틴으로 코팅된 멀티웰 플레이트의 주위 세포 배지에서 후속 세포 계대는 내피 세포를 제거하면서 주위 세포 성장을 촉진합니다.

병원균이 없는 4주에서 6주 된 수컷 C57 흑색 6 마우스의 뇌를 멸균되고 건조하며 보푸라기가 없는 물티슈 위에 놓고 구부러진 팁 겸자를 사용하여 소뇌, 선조체 및 후두 신경을 제거합니다. 면봉을 사용하여 눈에 보이는 수막을 모두 제거하고 뇌 조직을 거꾸로 뒤집습니다. 바깥쪽으로 가볍게 스트로크하여 엽을 열고 눈에 보이는 모든 혈관을 제거합니다. 그런 다음 수막이 없는 뇌 조직을 15밀리리터의 저온 세척 완충액 B가 들어 있는 100밀리미터 페트리 접시에 넣습니다.

조직을 균질화하려면 뇌 샘플을 Dounce Tissue Grinder 모르타르 튜브로 옮기고 3-4밀리리터의 세척 완충액 B를 튜브에 추가합니다. 느슨한 유봉을 사용하여 조직을 55번 다집니다. 그런 다음 유봉을 세척 완충액 B로 헹구고 단단한 유봉으로 조직 슬러리를 25회 다집니다. 균질화가 끝나면 두 개의 50밀리리터 튜브 사이에 슬러리를 균등하게 분취하고 차가운 30% 소 혈청 알부민 덱스트란의 1.5배를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 세게 흔들어 슬러리를 혼합합니다.

혈관 분획을 분리하려면 원심분리로 세포를 침전시키고 상청액을 두 개의 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 얼음 위의 세척 완충액 B에 보관하십시오. 얼음 위에 3밀리리터의 차가운 세척 완충액 B에 펠릿을 재현탁합니다.

수확한 상청액을 원심분리하고 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 세척 완충액 B 3밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 재현탁된 펠릿을 풀링하고 풀링된 세포 현탁액의 최종 부피를 신선한 차가운 세척 완충액 B와 함께 10밀리리터로 가져옵니다.

또한 남아 있는 펠릿 덩어리가 보이지 않을 때까지 10mm 피펫으로 세포를 6회 해리하고 진공 필터 어셈블리와 나일론 메쉬 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 여과합니다. 여과기를 페트리 접시에 넣고 신선한 세척 완충액 B로 메쉬를 청소하고 긁어서 모세관을 회수합니다. 그런 다음 새 필터로 두 번째 여과를 수행합니다.

여과액을 두 개의 튜브 사이에 균등하게 나누고 원심분리로 세포를 수집합니다. 상청액을 버린 후, 효소가 포함된 예열된 세척 완충액 B가 들어 있는 단일 튜브에 펠릿을 풀고 예열된 콜라게나제 분산제를 튜브에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 정확히 33분 동안 진탕 테이블 수조에 넣은 후 30밀리리터의 저온 세척 완충액 B로 반응을 중단합니다.

원심분리로 세포를 수집하고 상청액을 조심스럽게 버립니다. 펠릿을 세척 완충액 B에 빠르고 조심스럽게 재현탁한 후 현탁액을 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 완전한 DMEM 배지의 밀리리터에 재현탁시키고 3개의 Matrigel 코팅된 6웰 플레이트의 9개의 웰에 완전한 DMEM에 2밀리리터의 세포 현탁액을 시드합니다.

세포 배양물을 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 멸균 24시간 동안 넣은 후 각 웰에서 파편을 조심스럽게 제거하고 신선한 DMEM 배지를 추가합니다. 48시간 후 48시간마다 각 웰의 배지를 교체합니다. 8일에서 10일째, 세포가 100% 합류에 도달하면 기생충 배양 배지의 세포를 새로운 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 계대시키고 모니터링하면서 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.