Obtaining a Single-Cell Suspension from Mouse Hippocampal Tissue

0 조회수3:42 • July 8th, 2025

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관류된 성체 마우스 해마 조각을 파파인과 DNase가 들어 있는 해리 튜브에 넣습니다.

튜브를 기계적 해리기 위에 놓습니다.

해리제는 조직을 기계적으로 분해하여 뉴런과 신경교세포를 포함한 세포를 느슨하게 합니다.

파파인은 조직의 세포외 기질을 분해하여 세포를 방출합니다. DNase는 오염된 DNA를 분해합니다.

효소를 비활성화하는 BSA를 함유한 완충액을 첨가합니다.

스펜션을 스트레이너에 통과시켜 큰 잔해물을 제거합니다.

여과액을 원심분리합니다. 효소가 풍부한 상청액을 버리십시오.

세포를 완충액에 재현탁하고 새 튜브로 옮깁니다.

밀도 구배 배지를 추가하고 혼합한 다음 혼합물을 버퍼로 오버레이합니다.

원심분리하는 동안 세포와 파편은 밀도에 따라 별도의 층을 형성합니다.

맨 위 버퍼 레이어와 중간 파편 레이어를 제거합니다.

세포가 포함된 맨 아래 레이어에 버퍼를 추가하고 혼합합니다. 밀도 구배 배지를 포함하는 상청액을 원심분리하고 폐기합니다.

추가 분석을 위해 해마 세포를 완충액에 재현탁합니다.

집게를 사용하여 해마 조직 조각을 C-튜브로 옮기고 30마이크로리터의 효소 혼합물 2를 튜브에 추가합니다. 캡을 비틀고 딸깍 소리가 날 때까지 조인 후 튜브를 해리기에 넣고 적절한 프로그램을 실행합니다. 프로그램이 실행되는 동안 2밀리리터의 BSA 완충액과 함께 50밀리리터 원뿔형 튜브에 놓인 70미크론 세포 여과기를 미리 적십니다.

해리 프로그램이 완료된 후 해리된 조직에 4밀리리터의 BSA 완충액을 첨가하고 50밀리리터 원추형 튜브의 세포 스트레이너를 통해 혼합물을 여과합니다. 그런 다음 C-튜브에 DPBS 10밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 닫고 용액을 부드럽게 휘젓고 50밀리리터 원추형 튜브의 셀 스트레이너를 통해 여과합니다. 여과된 세포 현탁액을 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리고 펠릿을 보관하십시오.

파편 제거를 위해 펠릿을 1,550마이크로리터의 차가운 DPBS로 재현탁하고 현탁액을 라벨이 붙은 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 450마이크로리터의 차가운 파편 제거 용액을 넣고 위아래로 피펫팅합니다. 1밀리리터의 차가운 DPBS로 세포 현탁액을 부드럽게 겹쳐서 팁을 원추형 튜브의 벽에 유지합니다. 총 오버레이가 2밀리리터가 될 때까지 절차를 반복합니다.

다음으로, 현탁액을 3,000배 g에서 최대 가속 및 최대 제동으로 10분 동안 원심분리합니다. 최상층을 흡인합니다. 그런 다음 피펫 팁을 앞뒤로 쓸어 흰색 중간층을 흡인합니다. 맨 아래 레이어를 방해하지 않고 가능한 한 많은 중간 레이어를 제거합니다. 그런 다음 차가운 DPBS 2밀리리터를 넣고 위아래로 피펫을 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 서스펜션을 1,000배 g에서 최대 가속 및 최대 제동으로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿을 1밀리리터 BSA 완충액에 재현탁합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026