쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

0 조회수3:51 • July 8th, 2025

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뇌의 세포외 기질 또는 ECM 내에 신경, 비신경 및 면역 세포가 있는 쥐 뇌부터 시작합니다.

조직을 다지고 배양 배지에 재현탁합니다.

이 조직 조각을 튜브로 옮기고 콜라게나제 및 DNase-I 효소로 처리합니다.

콜라게나제는 ECM을 소화하여 개별 세포를 방출하는 반면, DNase-I는 유리 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지합니다.

그런 다음 EDTA를 첨가하여 콜라게나제 효소를 비활성화합니다.

배양 배지를 추가합니다. 원심분리하여 상층액을 제거합니다.

밀도 구배 용액과 배양 배지를 세포 펠릿에 첨가하여 저밀도 구배 층을 만듭니다.

액을 혼합한 다음 고밀도 그래디언트 용액과 밑에 깔아 밀도 차이를 설정합니다.

저속으로 원심분리하여 계면에서 면역 세포를 분리하고, 상단에는 더 가벼운 세포 파편이 있고 하단에는 더 무거운 신경 세포와 신경교 세포가 있습니다.

상층을 제거하고 면역 세포를 수집하여 다른 튜브로 옮깁니다.

원심분리하여 상청액을 제거한 다음 세포를 배지에 재현탁하여 다운스트림 적용을 위한 단일 세포 현탁액을 형성합니다.

배지와 함께 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시에 붓고 집게를 사용하여 조직을 바닥으로 이동합니다. 멸균 면도날로 뇌 조직을 다지고 접시 바닥에 조직을 모으십시오. 10% FCS가 보충된 RPMI 3밀리리터를 페트리 접시에 첨가한 다음 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 조직을 배지에 재현탁하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

콜라게나제 I형과 DNase I을 조직에 첨가하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 40분 동안 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직과 효소를 완전히 혼합합니다. 배양 후, 최종 농도 0.01 몰이 되도록 각 튜브에 EDTA를 첨가하고 튜브를 추가로 5분 동안 배양하여 콜라게나제를 비활성화합니다.

각 튜브에 10% FCS를 보충한 RPMI 9밀리리터를 추가한 다음 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 450g으로 원 심분리합니다. 진공이 있는 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿에 닿지 않도록 주의하면서 상청액을 흡인합니다.

세포 펠릿에 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액 3밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 10밀리리터로 만들고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 뒤집고 잘 섞습니다. 그런 다음 1밀리리터의 70% 스톡 등장성 밀도 구배 용액이 담긴 혈청학적 피펫을 튜브 바닥에 삽입합니다.

거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액을 천천히 밑에 깔아주세요. 기울기를 방해하지 않도록 튜브에서 혈청학적 피펫을 제거합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 800g으로 원심분리한 다음 튜브에 2-3밀리리터가 남을 때까지 미엘린 파편층을 포함한 상청액을 흡인합니다.

1밀리리터 피펫을 사용하여 30%에서 70% 밀도 구배 사이의 세포층을 수확하고 새 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. RPMI 10% FCS 배지를 첨가하여 최종 부피를 15밀리리터로 만든 다음 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 450g 으로 원심분리합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026