Labeling Neural Cell Surface Markers with Azidosugar(아지도슈가(Azidosugar)를 사용한 신경 세포 표면 마커 라벨링(Labeling Neural Cell Surface Markers with Azidosugar) 및 내피 세포(Endothelial Cells)와의 공동 배양

트랜스웰 플레이트의 투과성 멤브레인 삽입물에 마우스 뇌 내피 세포 현탁액을 추가하는 것으로 시작합니다.

바닥에 성장 배지를 넣고 배양합니다.

배지의 성장 인자와 영양소는 세포가 단층으로 성장하도록 돕습니다.

하단 웰과 인서트에서 배지를 제거합니다.

인서트의 내부 및 외부 표면을 세척하여 이물질을 제거합니다.

삽입물에 부착 배지를 추가하고 삽입물을 일차 피질 신경 줄기 및 전구 세포(NSPC)를 포함하는 매트릭스 코팅 웰로 옮기고 배양합니다.

비천연 시알산 전구체 유사체인 아지도설탕을 내피 세포와 NSPC 모두에 첨가하고 배양합니다.

내피 세포에서 분비되는 사이토카인과 케모카인은 NSPC가 큰 시트 모양의 클론으로 성장하는 것을 촉진합니다.

아지시당은 NSPC 세포 표면의 sialoglycan 구조에 통합되어 당단백질을 표지합니다. 이를 통해 확장된 NSPC에서 세포 표면 단백질을 식별할 수 있습니다.

내피 세포를 준비하기 위해 0.10cm 페트리 접시에서 BEND3 세포 펠릿을 9밀리리터의 BEND3 세포 배지와 90% 합류로 재현탁합니다. 1밀리리터의 세포 현탁액을 하나의 투과성 지지 인서트에 첨가합니다. 매트릭스의 하단 챔버에 웰당 2밀리리터의 BEND3 배지를 추가합니다. 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 하루 동안 세포를 계속 배양합니다.

인서트에 세포를 도금한 후 하루 후, 먼저 하단 챔버에서 배지를 흡인한 다음 인서트에서 부드럽게 흡인합니다. 예열된 DMEM으로 인서트의 표면을 세 번 세척합니다. 예열된 DMEM으로 헹구어 인서트의 외부 표면을 세척합니다. 그런 다음 예열된 AM 1밀리리터를 하나의 인서트에 추가합니다. 인서트를 일차 피질 세포가 있는 웰로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 공동 배양을 12시간 동안 배양합니다.

Ac₄ManNAz를 DMSO에 용해시켜 200밀리몰의 스톡 농도를 달성합니다. 인큐베이터에서 신경 내피 공동 배양 플레이트를 회수합니다. 각 하단 챔버에 Ac₄ManNAz 스톡 1마이크로리터를 추가하고 삽입물당 0.5마이크로리터를 공동 배양에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 5일 동안 배양합니다. 세포가 배양되는 동안 삽입물당 100마이크로리터의 RM과 하단 챔버당 200마이크로리터의 RM을 추가하여 격일로 내피 및 신경 세포에 재공급합니다.