마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

분화 배지를 포함하는 저부착 접시에 마우스 배아 줄기 세포를 종자합니다.

세포 응집 및 신경 계통으로의 분화를 촉진하기 위해 회전 하에 배양합니다.

골재를 튜브로 옮기고 중력에 의해 가라앉도록 합니다. 미디어를 버립니다.

응집체를 재현탁하고 레티노산이 보충된 분화 배지를 포함하는 원래 접시로 옮깁니다.

레티노산은 신경 유전자 발현을 유도하여 신경 전구 세포로의 분화를 촉발합니다.

골재를 튜브로 옮깁니다. 배지를 제거하고 트립신을 첨가하여 응집체를 해리시킵니다.

트립신을 중화시키기 위해 억제제를 첨가하십시오.

균질한 세포 현탁액을 얻기 위해 반복적으로 피펫팅합니다. 현탁액을 여과하여 골재를 제거합니다.

원

심분리하여 상층액을 제거합니다. 배지에 세포를 재현탁합니다.

세포 접착을 촉진하기 위해 폴리머 코팅 접시에 세포를 파종합니다.

미디어를 제거합니다. 성장 인자를 함유한 신선한 배지를 추가하여 뉴런 성숙을 촉진하고 네트워크로 연결된 뉴런 집단을 형성합니다.

ESC의 뉴런으로의 분화는 일상적인 세포 계대 중에 시작됩니다. 이전과 같이 ESC를 해리하되 신경 분화를 위한 추가 플레이트를 포함합니다. 350마이크로리터의 세포 현탁액을 25밀리리터의 분화 배지가 들어 있는 10센티미터의 저부착 접시에 옮깁니다.

접시를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 조직 배양 인큐베이터 내에서 30-45RPM으로 설정된 궤도 셰이커에 놓고 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 25밀리리터 피펫을 사용하여 분화 세포 응집체를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

그

직후, 페트리 접시에 신선한 분화 배지 25밀리리터를 첨가합니다. 응집체가 2-5분 동안 가라앉도록 하여 1-2mm 깊이의 눈에 보이는 펠릿을 생성합니다. 아직 현탁액 상태에 있는 단일 세포 또는 작은 응집체를 무시하고 배지를 조심스럽게 흡인하고 P1000 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 접시를 인큐베이터의 회전식 셰이커로 되돌립니다. 48시간 더 후에 미디어 변경 절차를 반복합니다. 이번에는 6마이크로몰 올트랜스 레티노산이 보충된 분화 배지 30밀리리터를 추가합니다.

형성된 펠릿은 이제 깊이가 2-4mm가 됩니다. 이전과 같이 세포를 배양한 후, 마지막으로 레티노산 보충으로 배지 교체 절차를 반복합니다. 이 시점에서 펠릿의 깊이는 4-8mm입니다.

다음날, 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 도금 표면을 준비합니다. 도금 당일 오후, 미리 분취