마우스 좌골 신경에서 슈반 세포의 자기 분리

효소적으로 소화된 마우스 좌골 신경 섬유에서 세포와 파편의 현탁

액을 취하십시오.

스트레이너를 통과하여 파편을 제거합니다.

여과액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

세포를 혈청 함유 배지에 재현탁하고 접착 단백질 코팅 배양 플레이트에 시딩합니다.

세포 접착을 위해 배양합니다. 배지를 Schwann 세포 배지로 교체합니다. Schwann 세포 단층 형성을 위해 배양합니다.

배지를 제거하고 버퍼로 세척합니다. 트립신과 함께 배양하여 세포를 분리합니다.

효

소 활성을 멈추기 위해 혈청이 함유된 배지를 추가합니다.

세포를 모으고 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.

세포를 완충액에 재현탁하고 항체 코팅된 자성 마이크로비드를 추가합니다.

섬유아세포 당단백질에 대한 항체에 결합하기 위해 배양합니다.

원심분리하여 상청액을 버립니다. 세포를 완충액에 재현탁하고 자기 분리기의 자기장에 배치된 강자성 구체가 포함된 자기 분리 컬럼에 로드합니다.

자기장은 마이크로비드에 결합된 섬유아세포를 유지하여 슈완 세포가 플로우 스루에 수집될 수 있도록 합니다.

소화된 신경을 50밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 4도에서 10분간 188g으로 원심 분리한다. 상청액을 버린 후, 10% FCS와 겐타마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 DMEM 10밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다.

다음으로, 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 섭씨 4도에서 188g에서 10분간 원심분리한 후, FCS와 겐타마이신을 함유한 DMEM 4밀리리터로 펠릿을 재현탁한다. 2개의 폴리-L-라이신 및 라미닌 코팅된 60mm 조직 배양 접시 각각에 2밀리리터의 세포 현탁액을 첨가합니다. 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양하고 인큐베이터에서 2일 동안 플레이트를 그대로 둡니다.

Schwann 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 188g으로 원심분리하고 세포 펠릿을 1 x 10 ⁷ 세포당 90마이크로리터의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 1 x 10^{7 세포}당 10마이크로리터의 Thy-1 마이크로비드를 추가합니다. 재현탁된 용액을 섭씨 8도의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 세포 현탁액에 자기 세포 분리 완충액 2밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 300g으로 원심분리한 후, 펠릿을 500마이크로리터의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 자성 세포 분리 컬럼을 세포 분리기에 넣고 1밀리리터의