0 조회수 • 4:43 분 • July 8th, 2025
차가운 균질화 완충액에서 마우스 뇌에서 치상회를 채취합니다.
기계적으로 해리되어 뉴런, 아교세포 및 줄기 세포를 방출합니다.
완충액의 순한 세제는 세포를 투과시켜 핵과 기타 소기관을 방출합니다.
균질을 여과하여 조직 파편을 제거합니다. 그런 다음 원심분리하여 소기관을 제거하고 균질화 완충액에 재현탁하여 온전한 세포를 용해합니다.
다시 원심분리하고, 방출된 소기관을 포함하는 상청액을 제거하고, 핵을 세척 완충액에 재현탁합니다.
여과하여 잔해물을 제거하고 원심분리하여 상층액을 제거합니다.
형광 DNA 염색을 도입하여 모든 핵을 표지하고 뉴런 핵을 표지하는 뉴런 핵 항원 또는 NeuN에 결합하는 형광단 접합 항체를 도입합니다.
형광 활성화 핵 분류를 사용하여 DNA 염색 형광 강도가 높고 산란 특성이 높은 응집체를 식별하여 단일 핵을 분리합니다.
단일 핵을 분석하여 NeuN 양성 신경 핵을 분리하고 신경교세포와 줄기 세포에 속하는 NeuN 음성 핵을 분리합니다.
느슨한 A 유봉을 10번 한 다음 단단한 B 유봉을 15번 스트로크하여 조직을 균질화합니다. 균질을 미리 냉각된 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. Dounce 균질화기를 1밀리리터의 차가운 HB로 헹구고 같은 튜브와 결합합니다.
15밀리리터 튜브에 HB 3밀리리터를 넣고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 이 핵 현탁액을 두 번 혼합합니다. 0.5밀리리터의 HB를 사용하여 50밀리리터 시험관 위에 놓인 70마이크로미터 스트레이너 캡을 미리 적십니다. 그런 다음 0.5밀리리터의 HB로 세포 여과기를 세척하기 전에 핵 현탁액을 걸러냅니다.
다음으로 세포 스트레이너를 제거하고 시험관을 스윙 버킷 원심분리기에서 500g으로 섭씨 4도에서 5분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 버리십시오. P1000 피펫을 사용하여 펠릿을 HB 4밀리리터에 부드럽게 재현탁합니다.
얼음 위에서 5분 동안 배양한 후, 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 500g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 3밀리리터의 세척 배지에 재현탁합니다. 0.5밀리리터의 세척 매체를 사용하여 50밀리리터 시험관 위에 35마이크로미터 스트레이너 캡을 미리 적십니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 한 번에 0.5밀리리터의 현탁액을 피펫팅하여 핵 현탁액을 변형시킵니다.
0.5ml의 세척 매체로 스트레이너 캡을 세척한 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 여과액을 새 15밀리리터 튜브로 옮기고 500g에서 섭씨 4분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 3밀리리터의 세척 매체에 재현탁합니다.
원심분리를 반복하고, 마우스 항-Neu 및 AlexaFlour488 접합 항체와 밀리리터당 1마이크로그램 DAPI가 포함된 세척 배지 1밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속의 얼음 위에서 반응을 45분 동안 배양합니다.
형광 활성화 핵 분류 또는 FANS의 경우 면역염색된 핵 현탁액을 5밀리리터 시험관으로 옮기고 유세포 분석 절차가 시작될 때까지 얼음 위에 놓습니다.
튜브를 FACS 기기에 넣기 전에 온화한 강도로 3초 동안 샘플을 소용돌이치십시오.
염색 핵 현탁액에서 데이터를 얻으려면 DAPI 높이와 DAPI 영역의 게이트를 설정하여 세포 파편과 응집된 핵을 배제합니다. 그런 다음 로그 측면 산란 또는 SSC 영역과 로그 전방 산란 또는 FSC 영역의 게이트를 설정하여 나머지 DAPI 염색 응집체 또는 세포 파편에서 단일 핵을 분리합니다.
그런 다음 항-NeuNAF488 및 FSC 영역에 대한 게이트를 설정하여 NeuNAF488 음성 집단을 분리합니다.
분석 후, 게이팅 전략을 사용하여 50마이크로리터의 세척 매체로 채워진 1.5밀리리터 수집 튜브에서 항-NeuNAF488 음성 집단을 분류합니다.