Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

0 views • 4:09 min • July 8th, 2025

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쥐 뇌의 뇌량에서 염색된 탈수초성 병변을 해부합니다.

이러한 병변에는 세포 표면 인테그린 CD11b를 발현하는 뇌 상주 미세아교세포가 포함되어 있습니다.

조직을 수집하고 단백질 분해 효소와 DNase가 포함된 용액을 추가합니다.

효소는 세포외 기질을 분해하는 반면 DNase는 유리 DNA를 분해합니다.

콜드 버퍼를 첨가하고 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하여 세포 덩어리를 제거합니다.

원심분리하고 상청액을 버리고 펠릿화된 세포를 밀도 구배 배지에 재현탁합니다.

완충액과 원심분리기로 오버레이하여 상층에 남아 있는 파편을 수집합니다. 온전한 세포는 바닥에 가라앉습니다.

파편을 제거하고 세포를 완충액에 재현탁합니다.

항-CD11b 마그네틱 비드를 추가하여 미세아교세포를 표지합니다.

자기 분리기의 자기장에 배치된 강자성 구체가 포함된 컬럼에 셀을 로드합니다.

외부 자기장 아래에서 비드에 결합된 미세아교세포는 결합되지 않은 세포가 흐르는 동안 컬럼에 유지됩니다.

자기장에서 컬럼을 제거합니다. 미세아교세포를 용리하기 위해 완충액을 첨가하십시오.

입체 현미경으로 뇌량 주위에 중성 염료로 표시된 병변을 미세해부하는 것으로 시작합니다. 해부된 조직을 300 x g에서 30초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 샘플을 수집합니다. 효소 혼합물 1과 효소 혼합물을 인큐베이터에서 섭씨 2도에서 37도까지 예열합니다. 그런 다음 1,950마이크로리터의 예열된 효소 혼합물 1을 1대 1의 샘플에 넣고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5분 동안 분해합니다. 예열된 효소 믹스 2 30마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞습니다.

소화 후 4밀리리터의 차가운 PBS를 튜브에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 조직 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 300 x g으로 원심분리하고 상청액을 천천히 완전히 흡인합니다. 세포 펠릿을 1,550마이크로리터의 차가운 PBS로 부드럽게 재현탁합니다. 잔해물 제거를 위해 450마이크로리터의 차가운 용액을 넣고 잘 섞습니다.

1000마이크로리터 피펫을 사용하여 혼합물을 2밀리리터의 차가운 PBS와 함께 매우 천천히 부드럽게 겹쳐 놓습니다. 혼합물을 원심분리한 다음 3개의 층을 찾습니다. 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 2개의 최상층을 완전히 흡인하고 튜브에 최대 5밀리리터의 콜드 로딩 완충액을 채웁니다. 튜브를 부드럽게 3회 뒤집습니다.

다음으로, 상청액의 원심분리 및 흡인 후, 세포 펠릿을 90마이크로리터의 로딩 완충액으로 재현탁하고 10마이크로리터의 CD11b 비드를 추가합니다. 잘 섞어 섭씨 4도에서 15분간 배양합니다. 배양 후 로딩 완충액 1밀리리터를 넣고 1000마이크로리터 피펫으로 액체를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 세척합니다.

세포를 섭씨 4:00도에서 10분 동안 300 x g으로 원심분리하고 상청액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거합니다. 세포를 500마이크로리터의 로딩 완충액에 재현탁하고 자기장에서 양성 선택을 위해 분리기와 함께 MS 컬럼을 배치합니다. 세포를 보호하기 위해 500마이크로리터의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구고 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 분류의 효율성을 보장합니다.

세포 현탁액을 MS 컬럼에 바르고 표지되지 않은 세포가 포함된 플로우스루를 버립니다. 500마이크로리터의 로딩 버퍼를 첨가하여 컬럼을 세척하고 분리기에서 제거합니다. 컬럼을 15밀리리터 원심분리기 튜브에 놓고 로딩 버퍼 1밀리리터를 컬럼에 추가합니다. 마지막으로 플런저를 컬럼 바닥으로 밀어 자기 표지된 셀을 씻어냅니다.

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Last updated: 1 August 2026