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신경과학
0 조회수 • 2:59 분 • July 8th, 2025
선충 성장 배지에 유전자 조작 박테리아를 섭취하십시오.
박테리아는 선충 염색질 조절 인자 유전자가 있는 플라스미드를 운반합니다.
배지에는 염색질 조절 인자 유전자를 dsRNA로 전사하는 박테리아 게놈에서 형질전환 RNA 중합효소의 발현을 유발하는 유도제가 포함되어 있습니다.
열충격 프로모터 아래에 뉴런 운명 유도 전사 인자 유전자를 운반하는 형질전환 선충 유충을 추가합니다.
박테리아 섭취 시 섭취된 dsRNA는 염색질 조절 인자 발현을 하향 조절하는 siRNA를 생성하여 세포 운명 재프로그래밍을 촉진합니다.
부모의 생식 세포를 통해 siRNA는 자손에게 전달됩니다.
돌출된 외음부 표현형으로 표시되는 자손 생식 세포에서 염색질 조절 인자 발현의 하향 조절은 재프로그래밍을 허용합니다.
자손에게 열충격을 가하여 열충격 촉진제를 활성화하고 신경 분화를 유발하는 뉴런 운명 유도 전사 인자를 발현하여 생식 세포를 뉴런으로 변환합니다.
뉴런은 형질전환 형광 리포터 단백질을 발현하여 현미경적 시각화를 촉진합니다.
반복당 50개의 L4 웜을 NGM RNAi 플레이트로 수동으로 옮깁니다. 백금 와이어를 사용하십시오. L4 벌레는 복부 측면을 따라 약 절반에 있는 흰색 패치로 인식할 수 있습니다. 이제 웜을 섭씨 15도의 어둠 속에서 약 7일 동안 배양합니다. IPTG는 빛에 민감합니다.
F1 자손이 L3 및 L4 단계에 도달하면 더 크고 두꺼운 부모 동물과 분리합니다. 이 시점에서 lin-53에 대한 RNAi가 성공했음을 나타내는 돌출된 외음부 표현형에 대해 F1을 스크리닝합니다. RNAi 활성은 또한 섭씨 15도 이상에서 증가하는 치사율을 초래할 수 있습니다. G1을 활성화하고 F1 자손에서 생식 세포에서 뉴런으로의 전환을 유도하려면 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 벌레를 열 충격합니다. 통풍이 잘되는 인큐베이터를 사용하면 보다 효율적인 열 충격이 가능하므로 사용할 수 있습니다.
열 충격 후 어둠 속에서 밤새 섭씨 25도에서 플레이트를 배양합니다. 동물이 L3 중간 단계에 도달하기 전에 열 충격에 의한 Q1의 과발현을 유도하는 것을 피하는 것이 중요합니다. 이것은 표적이 아닌 조직에서 Q1 단백질의 발현으로 이어질 수 있습니다. 다음날, 형광 광원과 GFP 필터를 설치하여 중간 몸 영역에서 이식유전자 유래 형광에 대해 동물을 검사합니다.