human-induced pluripotent stem cells into microglia-like cells (인간 유도 만능 줄기 세포를 Microglia-like cells로 분화)

0 조회수4:03 • July 8th, 2025

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배아체 또는 EB 배지에 인간 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 낮은 접착력 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

세포를 침전시키기 위해 원심분리기. 배양하여 세포 증식 및 응집을 촉진하여 배아체를 형성합니다.

세포 계통 조절자는 골수 전구세포로의 세포 분화를 촉진합니다.

이러한 EB를 수집하여 세포외 기질 또는 ECM 코팅 플레이트의 가장자리로 옮깁니다.

배지를 원시 대식세포 전구체 또는 PMP 분화 배지로 교체하고 부드럽게 교반합니다. EB가 ECM에 부착되는 것을 용이하게 하기 위해 인큐베이팅합니다.

배지의 절반을 교체하고 배양합니다.

조혈 성장 인자는 골수 전구세포를 원시 대식세포 전구체로 분화시켜 EB에서 분리되어 배지에 나타납니다

.

이러한 PMP를 수집하고 셀을 회전시킵니다. 미세아교세포 분화 배지에 재현탁합니다.

이 세포를 라미닌 코팅된 멀티웰 플레이트에 시드하고 배양합니다.

PMP는 분화 인자와 영양소를 활용하여 뇌 면역 세포의 일종인 미세아교세포 유사 세포로 분화합니다.

도금 세포의 경우, 웰당 100마이크로리터의 희석된 세포를 낮은 접착력의 둥근 바닥 96웰 플레이트에 첨가합니다. 플레이트를 125배g에서 3분 동안 원심분리하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 4일 동안 배양합니다.

2일째에 다중 채널 피펫을 사용하여 기존 하프 EB 배지를 새 배지로 교체합니다. 원시 대식세포 전구체 또는 PMP를 생성하려면 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 마트리겔 코팅 용액을 첨가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.

EB 분화 4일째에 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 EB를 매트리겔 코팅 웰로 옮깁니다. 위아래로 피펫팅하여 우물에서 EB를 제거합니다. 그런 다음 EB가 우물 가장자리에 안착할 수 있도록 플레이트를 기울인 상태로 유지합니다.

모든 EB가 안정되면 새로 준비된 PMP 완전 배지 3밀리리터로 웰 가장자리에 EB를 유지하면서 부드럽게 피펫팅하고 기존 배지를 교체합니다. 플레이트를 좌우 및 뒷뒤로 수동으로 섞어 웰의 세포를 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 EB가 웰 바닥에 부착될 수 있도록 플레이트를 7일 동안 배양합니다.

7일 후 4배 배율의 광장 현미경으로 EB를 검사하여 우물 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 반 배지 교체를 수행하고 21일째에 전체 배지를 PMP 완전 배지 3밀리리터로 교체합니다.

28일째에 상청액에서 PMP라고 하는 둥근 세포를 찾습니다. 그런 다음 EB를 방해하지 않고 10밀리리터 피펫과 자동 피펫터를 사용하여 PMP를 포함하는 배지를 수집합니다.

배지의 PMP를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 수집된 PMP를 200배 g에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한 후 1-2밀리리터의 미세아교세포 유사 세포 또는 IMG 기저 배지에 재현

탁합니다.

그런 다음 앞서 설명한 대로 혈구계에서 세포의 수를 계산합니다. 나머지 세포를 원심분리하고 PMP를 원하는 농도로 희석합니다. 그런 다음 새로 준비된 IMG 완전 배지를 사용하여 세포 배양 처리된 플레이트에 평방 센티미터당 105 세포의 밀도로 세포를 도금합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026